用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的引物组。所述引物组包括分别针对IGF1R基因和参考基因Actin的特异性引物及探针。本发明专利技术还涉及一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的试剂盒。所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括检测IGF1R基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，还包括PCR buffer、dNTP、HS Taq酶及超纯水。本发明专利技术还涉及一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的方法。本发明专利技术提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测时间短、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用。

Primer groups, kits and methods for the detection of IGF1R expression level of tyrosine kinase inhibitor related genes

【技术实现步骤摘要】
用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及体外诊断
，尤其涉及一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
肿瘤细胞中存在丰富的EGFR酪氨酸激酶(TK)受体，EGFR旁路的其他TK受体如肝细胞生长因子受体(c-MET)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)和胰岛素样生长因子I型受体(Insulin-likegrowthfactors-Ireceptor，IGF1R)等可以直接活化EGFR下游信号通路，将细胞外信号传递到细胞内，调节细胞的基本功能即生存与增殖；当这些生长因子TK受体明显上调，活性超过EGFR时，EGFR下游信号通路的活化就不依赖于EGFR，从而引起肿瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)如吉非替尼、厄洛替尼的耐药。IGF1R(又称为CD221或JTK13)是一种酪氨酸激酶跨膜蛋白，是胰岛素样生长因子(IGF)系统中最为重要的因子。IGF1R及其配体(IGF-I和IGF-II)结合后启动2条信号传导途径:①PI3K-AKT途径；②MAPK途径，可促进细胞集落的形成，使细胞获得转化功能、抗细胞凋亡及促有丝分裂。IGF1R在许多肿瘤中表达上调或激酶活性增加，并且介导肿瘤发展、浸润、转移及抗凋亡等。研究发现，IGF1R过表达的非小细胞肺癌(NSCLC)患者提示预后较差。最近的研究结果证实IGF1R活化参与肿瘤细胞耐受EGFR-TKI，肿瘤获得对吉非替尼耐药不是通过改变EGFR的表达，而是通过上调和活化其他与增殖和(或)抗凋亡有关的活性分子，如IGFR、PI3K/AKT等。IGF1R信号途径的替代性激活是肿瘤耐受EGFR-TKI的可能途径之一。研究表明，在NSCLC的治疗中，IGF1R的过表达可引起患者对厄洛替尼、吉非替尼的耐药。目前，在临床疾病标志物实际的检测方法中，主要应用免疫组化法(化学染色)、流式细胞技术、免疫放射法等，技术普及性好、观察直观且相对传统，但存在实验过程过于繁琐，需要试剂种类繁多，结果读取主观影响较大等缺点，一定程度上限制了该方法临床上的进一步应用。近年来，RealTime-PCR凭借检测时间短、检测敏感性高(是免疫组织化学染色法的10倍以上)，而且能对PCR进行实时在线检测，反应基因在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生等优点逐渐在临床上部分取代传统检验方法。常见方法有SYBRGreenI染料法、双探针杂交法及Taqman探针技术；其中SYBRGreenI法由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法及Taqman法，且必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。综上所述，本专利技术采用TAQMAN探针技术与实时荧光PCR技术相结合的检测试剂盒，适用于临床推广和产业化。
技术实现思路
为了解决免疫组化法检测临床生物标志物时存在实验过程过于繁琐，需要试剂种类繁多，结果读取主观影响较大的技术问题，本专利技术提供一种操作简单、检测时间短、检测敏感性高及特异性好的用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的引物组、试剂盒及方法。本专利技术提供一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的引物组，所述引物组包括分别针对IGF1R基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：IGF1R-RF上游引物：5’-CTTGTACATTCGCACCAATGCT-3’；IGF1R-RR下游引物：5’-CGATTAACTGAGAAGAGGAGTTCGA-3’；IGF1R-RP探针：5’-FAM-CTTCCATTCCCTTGGACGTTCTTTCAGC-TRAMA-3’；Actin-RF上游引物：5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；Actin-RR下游引物：5’-AGGATGGAGCCGCCGAT-3’；Actin-RP探针：5’-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3’。本专利技术还提供一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括针对IGF1R基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：IGF1R-RF上游引物：5’-CTTGTACATTCGCACCAATGCT-3’；IGF1R-RR下游引物：5’-CGATTAACTGAGAAGAGGAGTTCGA-3’；IGF1R-RP探针：5’-FAM-CTTCCATTCCCTTGGACGTTCTTTCAGC-TRAMA-3’；Actin-RF上游引物：5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；Actin-RR下游引物：5’-AGGATGGAGCCGCCGAT-3’；Actin-RP探针：5’-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3’；所述PCR反应液还包括PCRbuffer、dNTP、HSTaq酶及超纯水。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述阳性对照品为含IGF1R基因的溶液；所述阴性对照品为不含IGF1R基因的溶液；所述空白对照品为超纯水。本专利技术还提供一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的方法，包括如下步骤：步骤一：取待检测样本抽提mRNA，将样本mRNA进行逆转录得到cDNA，以cDNA作为模板；步骤二：提供如上述所述的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述模板混匀；步骤三：利用上述的特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并分别以IGF1R标准基因作为阳性对照构建标准曲线，根据样本的Ct值计算出样本的底物浓度；比较标准曲线上计算出正常样本与病变样本的底物浓度，最终判断待检测样本中的mRNA表达水平。在本专利技术提供的所述方法的一种较佳实施例中，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性5min；95℃15sec，60℃30sec，捕捉荧光信号，循环40次。相较于现有技术，本专利技术提供的用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：一、通过设计特异性高的引物及TAQMAN-MGB荧光探针，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本专利技术具有操作简单、检测速度快、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用；二、通过在引物设计及试剂盒中增加Actin基因为参考基因，基于该内参基因具有mRNA表达稳定的优点，可以有效避免假阴性的发生，且还能较好地对目的基因表达量进行校正，从而提高本专利技术方法的灵敏度和重复性，使得检测结果更加准确可靠；三、基于本专利技术具有的上述优点，可以使得本专利技术在临床上具有很好的经济和社会效益，特别是对临床酪氨酸激酶抑制剂的个体化用药有着很好的知道意义，可为临床精准用药提供重要的参考依据，降低药物不合理使用的情形，降低全社会的医疗成本，节约社会医卫资源。附图说明图1为临床样本检测时的IGF1RmRNA的PCR扩增曲线图；图2为临床样本检测时的ActinmRNA的PCR扩增曲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括分别针对IGF1R基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：IGF1R‑RF上游引物：5’‑CTTGTACATTCGCACCAATGCT‑3’；IGF1R‑RR下游引物：5’‑CGATTAACTGAGAAGAGGAGTTCGA‑3’；IGF1R‑RP探针：5’‑FAM‑CTTCCATTCCCTTGGACGTTCTTTCAGC‑TRAMA‑3’；Actin‑RF上游引物：5’‑CCGACAGGATGCAGAAGGAG‑3’；Actin‑RR下游引物：5’‑AGGATGGAGCCGCCGAT‑3’；Actin‑RP探针：5’‑FAM‑ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC‑TRAMA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括分别针对IGF1R基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：IGF1R-RF上游引物：5’-CTTGTACATTCGCACCAATGCT-3’；IGF1R-RR下游引物：5’-CGATTAACTGAGAAGAGGAGTTCGA-3’；IGF1R-RP探针：5’-FAM-CTTCCATTCCCTTGGACGTTCTTTCAGC-TRAMA-3’；Actin-RF上游引物：5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；Actin-RR下游引物：5’-AGGATGGAGCCGCCGAT-3’；Actin-RP探针：5’-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3’。2.一种用于酪氨酸激酶抑制剂相关基因IGF1R表达水平检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括针对IGF1R基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：IGF1R-RF上游引物：5’-CTTGTACATTCGCACCAATGCT-3’；IGF1R-RR下游引物：5’-CGATTAACTGAGAAGAGGAGTTCGA-3’；IGF1R-RP探针：5’-FAM-CTTCCATTCCCTTGGACGTTCTTTCAGC-TRAMA-3’；Actin-RF上游引物：5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；Actin-RR下游引物：5’-AGGATGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：广东大臻医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44