用于伊马替尼相关基因C‑kit表达水平检测的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于伊马替尼相关基因C‑kit表达水平检测的引物组。所述引物组包括分别针对C‑kit基因和参考基因Actin的特异性引物及探针。本发明专利技术还涉及一种用于伊马替尼相关基因C‑kit表达水平检测的试剂盒。所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括检测C‑kit基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，还包括PCR buffer、dNTP、HS Taq酶及超纯水。本发明专利技术还涉及一种用于伊马替尼相关基因C‑kit表达水平检测的方法。本发明专利技术提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测时间短、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用。

For primer group, reagent kit and method for imatinib related gene C KIT expression detection

The invention relates to a primer set for imatinib related gene C KIT expression detection. The primers for C group including KIT gene and reference gene Actin specific primer and probe. The invention also relates to a kit for imatinib related gene C KIT expression detection. The kit includes PCR reaction liquid, the PCR reaction solution including the detection of C KIT gene and reference gene Actin specific primers and probes, including PCR buffer, dNTP, HS Taq enzyme and ultra pure water. The invention also relates to a method for imatinib related gene C KIT expression detection. The kit and detection method provided by the invention has the advantages of simple operation, short detection time, high sensitivity and specificity, and is especially suitable for popularization and application in clinical laboratory work.

【技术实现步骤摘要】
用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及体外诊断
，尤其涉及一种用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
C-kit(V-kithardy-zuckerman4felinesarcomaviraloncogenehomolog)蛋白属于原癌基因C-kit编码的Ⅲ型跨膜受体酪氨酸激酶家族成员，由胞内的酪氨酸激酶区，跨膜区和带有配体结合位点胞外区构成。与其配体结合后能激活自身酪氨酸蛋白酶活性，通过一系列反应激活下游信号转导通路，如：PI3K通路、JAK-STAT通路、Ras-Erk通路、SFK通路、磷酯酶C通路等，最终活化细胞内的转录因子，从而调节基因表达、控制细胞生长和增殖。研究发现，C-kit的过表达引起肺癌的扩散，因此在治疗中阻断C-kit的表达会提高治疗的抗癌功效。另外，C-kit的高表达是胃肠道间质瘤(GIST)发生的核心事件。伊马替尼是一种酪氨酸蛋白酶抑制剂，作用于酪氨酸蛋白激酶受体的ATP结合位点，从而阻止磷酸化的进行和信号通路的传导，最终抑制肿瘤细胞增殖而诱导细胞凋亡。研究发现，在GIST的治疗中，C-kitmRNA高表达时，对伊马替尼具有较强敏感性。另外在一项对黑色素瘤的研究中发现，C-kit的基因扩增在患者中的比率为7.4％，对这些患者使用伊马替尼，提高了患者的无进展生存期和中位无进展生存期。目前，在临床疾病标志物实际的检测方法中，主要应用免疫组化法(化学染色)、流式细胞技术、免疫放射法等，技术普及性好、观察直观且相对传统，但存在实验过程过于繁琐，需要试剂种类繁多，结果读取主观影响较大等缺点，一定程度上限制了该方法临床上的进一步应用。近年来，RealTime-PCR凭借检测时间短、检测敏感性高(是免疫组织化学染色法的10倍以上)，而且能对PCR进行实时在线检测，反应基因在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生等优点逐渐在临床上部分取代传统检验方法。常见方法有SYBRGreenI染料法、双探针杂交法及Taqman探针技术；其中SYBRGreenI法由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法及Taqman法，且必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。综上所述，本专利技术采用TAQMAN探针技术与实时荧光PCR技术相结合的检测试剂盒，适用于临床推广和产业化。
技术实现思路
为了解决免疫组化法检测临床生物标志物时存在实验过程过于繁琐，需要试剂种类繁多，结果读取主观影响较大的技术问题，本专利技术提供一种操作简单、检测时间短、检测敏感性高及特异性好的用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的引物组、试剂盒及方法。本专利技术提供一种用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的引物组，所述引物组包括分别针对C-kit基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：C-kit-RF上游引物：5’-CAGATTTCAGAGAGCACCAATCA-3’；C-kit-RR下游引物：5’-AATGGTCTACCACGGGCTTCT-3’；C-kit-RP探针：5’-FAM-TTACTCCAACTTAGCAAACTGCAGCCCCAA-TRAMA-3’；Actin-RF上游引物：5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；Actin-RR下游引物：5’-AGGATGGAGCCGCCGAT-3’；Actin-RP探针：5’-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3’。本专利技术还提供一种用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括针对C-kit基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：C-kit-RF上游引物：5’-CAGATTTCAGAGAGCACCAATCA-3’；C-kit-RR下游引物：5’-AATGGTCTACCACGGGCTTCT-3’；C-kit-RP探针：5’-FAM-TTACTCCAACTTAGCAAACTGCAGCCCCAA-TRAMA-3’；Actin-RF上游引物：5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；Actin-RR下游引物：5’-AGGATGGAGCCGCCGAT-3’；Actin-RP探针：5’-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3’；所述PCR反应液还包括PCRbuffer、dNTP、HSTaq酶及超纯水。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述阳性对照品为含C-kit基因的溶液；所述阴性对照品为不含C-kit基因的溶液；所述空白对照品为超纯水。本专利技术还提供一种用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的方法，包括如下步骤：步骤一：取待检测样本抽提mRNA，将样本mRNA进行逆转录得到cDNA，以cDNA作为模板；步骤二：提供如上述所述的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述模板混匀；步骤三：利用上述的特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并分别以C-kit标准基因作为阳性对照构建标准曲线，根据样本的Ct值计算出样本的底物浓度；比较标准曲线上计算出正常样本与病变样本的底物浓度，最终判断待检测样本中的mRNA表达水平。在本专利技术提供的所述方法的一种较佳实施例中，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性5min；95℃15sec，60℃30sec，捕捉荧光信号，循环40次。相较于现有技术，本专利技术提供的用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：一、通过设计特异性高的引物及TAQMAN-MGB荧光探针，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本专利技术具有操作简单、检测速度快、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用；二、通过在引物设计及试剂盒中增加Actin基因为参考基因，基于该内参基因具有mRNA表达稳定的优点，可以有效避免假阴性的发生，且还能较好地对目的基因表达量进行校正，从而提高本专利技术方法的灵敏度和重复性，使得检测结果更加准确可靠；三、基于本专利技术具有的上述优点，可以使得本专利技术在临床上具有很好的经济和社会效益，特别是对临床伊马替尼的个体化用药有着很好的知道意义，可为临床精准用药提供重要的参考依据，降低药物不合理使用的情形，降低全社会的医疗成本，节约社会医卫资源。附图说明图1为临床样本检测时的C-kitmRNA的PCR扩增曲线图；图2为临床样本检测时的ActinmRNA的PCR扩增曲线图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1：试剂盒的制备一、引物和探针的设计与合成针对人基因组中C-kit基因(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用PrimerPremier3.0及MethylPrimerExpressv1.0软件，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于伊马替尼相关基因C‑kit表达水平检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括分别针对C‑kit基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：C‑kit‑RF上游引物：5’‑CAGATTTCAGAGAGCACCAATCA‑3’；C‑kit‑RR下游引物：5’‑AATGGTCTACCACGGGCTTCT‑3’；C‑kit‑RP探针：5’‑FAM‑TTACTCCAACTTAGCAAACTGCAGCCCCAA‑TRAMA‑3’；Actin‑RF上游引物：5’‑CCGACAGGATGCAGAAGGAG‑3’；Actin‑RR下游引物：5’‑AGGATGGAGCCGCCGAT‑3’；Actin‑RP探针：5’‑FAM‑ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC‑TRAMA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括分别针对C-kit基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：C-kit-RF上游引物：5’-CAGATTTCAGAGAGCACCAATCA-3’；C-kit-RR下游引物：5’-AATGGTCTACCACGGGCTTCT-3’；C-kit-RP探针：5’-FAM-TTACTCCAACTTAGCAAACTGCAGCCCCAA-TRAMA-3’；Actin-RF上游引物：5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；Actin-RR下游引物：5’-AGGATGGAGCCGCCGAT-3’；Actin-RP探针：5’-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3’。2.一种用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括针对C-kit基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：C-kit-RF上游引物：5’-CAGATTTCAGAGAGCACCAATCA-3’；C-kit-RR下游引物：5’-AATGGTCTACCACGGGCTTCT-3’；C-kit-RP探针：5’-FAM-TTACTCCAACTTAGCAAACTGCAGCCCCAA-TRAMA-3’；Actin-RF上游引物：5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；Actin-RR下游引物：5’-AGGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：广东大臻医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44