单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种能够为临床给药提供指导且有利于丰富基因多态性研究的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用。该引物系统包括扩增引物对和测序引物，其中，所述扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述测序引物的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法采用多重PCR扩增检测位点所在基因片段手，采用荧光标记单碱基延伸技术进行DNP位点检测，在对患者使用伊立替康前检测其体内的UGT1A1*6情况，可以预测依立替康等药物的毒性，并允许选择个体化剂量或替代疗法，为肿瘤患者使用伊立替康及其类似物化疗提供了临床指导。

Primer system, method and application of single base extension method for detecting polymorphism of UGT1A1*6 gene

The invention discloses a primer system, a method and an application for detecting the polymorphism of UGT1A1*6 gene by single base extension method, which can provide guidance for clinical administration and enrich the research of gene polymorphism. The system includes one of the primer amplification primers and sequencing primers. The sequence of the primers of the upstream primer and downstream primer respectively, such as SEQ ID and SEQ NO:1 ID NO:2 shows the sequence of primers as shown in SEQ ID NO:3. The invention of the single base primer extension system, method of detection of UGT1A1*6 gene polymorphism with multiple PCR amplification loci gene fragment, using the fluorescence labeled single nucleotide extension technology for detecting DNP loci, in patients with irinotecan before detection of UGT1A1*6 in the situation, can predict irinotecan and other drugs the toxicity, and allow the choice of individual dose or replacement therapy, to provide clinical guidance for cancer patients using irinotecan chemotherapy and its analogues.

【技术实现步骤摘要】
单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用。
技术介绍
伊立替康(Irinotecan，CPT-11，也称为开普拓)对提高结直肠癌根治术后的长期生存率具有重要意义，同时也对肺癌、脑癌和乳腺癌等癌症具有有效的抗癌活性，是最普遍的化疗处方药物之一。伊立替康是一无活性的前药，在体内能够经羟酸酯酶活化转变为活性代谢产物SN-38而发挥效用。活性SN-38的主要清除途径是通过肝脏尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)的糖基化作用转变为无活性的SN-38G后经尿液、胆汁排出。UGT1A1基因启动子区具有一定多态性。UGT1A1基因型的检测可用于临床预测与CPT-11相关的严重毒副作用的发生，与国外研究相比，中国人与白种人结直肠癌患者UGT1A1家族各个基因SNP分布均存在显著性差异，中国人UGT1A1*28位点的野生型基因型(TA6/6)的分布显著偏高(72.9％对45.2％，P＝0.005)，而UGT1A1*6(211G>A，G71R)这一SNP在白种人中并未发现。这些在中国人群中分布较多的基因型，对应的UGT1A1活性均较高，对SN38的失活代谢作用较强。美国FDA建议伊立替康药品说明书标示适用基因型。中国国家卫生部在新的临床检验项目目录中也增列了“化学药品个体化用药基因检测项目”。UGT1A1基因型检测对于临床正确用药，减少毒副作用，提高疗效具有明确的临床意义。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种能够为临床给药提供指导且有利于丰富基因多态性研究的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法和应用。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下。一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，包括扩增引物对和测序引物，其中，所述扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述测序引物的序列如SEQIDNO:3所示。在其中一个实施例中，所述扩增引物对和/或所述测序引物的使用浓度为5.0+0.2pmol/μl。上述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统可应用在制备检测UGT1A1*6基因多态性试剂中。一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，含有上述任一实施例所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统。在其中一个实施例中，所述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、单碱基延伸试剂和毛细管电泳试剂中的至少一种。在其中一个实施例中，所述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒还包括基因型为A/A的纯合突变的阳性对照试剂。一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性的方法，使用上述任一实施例所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，所述方法包括如下步骤：使用所述扩增引物对对基因组DNA进行PCR扩增；使用所述测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸；对单碱基延伸的产物进行片段分析。在其中一个实施例中，所述PCR扩增的条件是：先95℃、5min；再依次95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，共44个循环；再72℃延伸5min。在其中一个实施例中，所述单碱基延伸的条件是：先94℃、10s；再依次53℃、5s，58℃、30s，共30个循环；最后4℃保温。在其中一个实施例中，所述对单碱基延伸的产物进行片段分析是对单碱基延伸的产物进行毛细管电泳，检测产物的峰值。本专利技术的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统、方法采用PCR扩增检测位点所在的基因片段，采用荧光标记单碱基延伸技术进行DNP位点检测，在对患者使用伊立替康前检测其体内的UGT1A1*6情况，可以预测依立替康等药物的毒性，并允许选择个体化剂量或替代疗法，为肿瘤患者使用伊立替康(开普拓/伊林特肯)及其类似物化疗提供了临床指导。附图说明图1为杂合突变的实验组的毛细管电泳峰图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。一实施方式的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，包括扩增引物对和测序引物。其中，扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，测序引物的序列如SEQIDNO:3所示。在一个实施例中，扩增引物对和/或测序引物的使用浓度为5.0±0.2pmol/μl。上述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统可应用在制备检测UGT1A1*6基因多态性试剂中。如一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，其含有上述任一实施例的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统。进一步，在一个实施例中，上述单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、单碱基延伸试剂和毛细管电泳试剂中的至少一种。PCR反应试剂中含有DNA聚合酶、dNTPs、含Mg2+的缓冲液等。更进一步，在另一个实施例中，该单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒还包括阳性对照试剂。阳性对照试剂含有基因型为A/A的纯合突变的模板DNA。本实施方式还提供了一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性的方法，其使用上述任一实施例的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，该方法包括如下步骤：使用扩增引物对对基因组DNA进行PCR扩增；使用测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸；对单碱基延伸的产物进行片段分析。在一个实施例中，PCR扩增的条件是：先95℃、5min；再依次95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，共44个循环；再72℃延伸5min。在一个实施例中，单碱基延伸的条件是：先94℃、10s；再依次53℃、5s，58℃、30s，共30个循环；最后4℃保温。在一个实施例中，对单碱基延伸的产物进行片段分析是对单碱基延伸的产物进行毛细管电泳，检测产物的峰值。本实施方式的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统特异性强，PCR扩增效率和单碱基延伸的效率都很高。该方法采用多重PCR扩增检测位点所在基因片段手，采用荧光标记单碱基延伸技术进行DNP位点检测，在对患者使用伊立替康前检测其体内的UGT1A1*6情况，可以预测依立替康等药物的毒性，并允许选择个体化剂量或替代疗法，为肿瘤患者使用伊立替康(开普拓/伊林特肯)及其类似物化疗提供了临床指导。以下为具体实施例部分。一、样本本实施例接收的样本为患者的外周血，外本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，其特征在于，包括扩增引物对和测序引物，其中，所述扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述测序引物的序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，其特征在于，包括扩增引物对和测序引物，其中，所述扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述测序引物的序列如SEQIDNO:3所示。2.如权利要求1所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统，其特征在于，所述扩增引物对和/或所述测序引物的使用浓度为5.0+0.2pmol/μl。3.如权利要求1或2所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统在制备检测UGT1A1*6基因多态性试剂中的应用。4.一种单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1或2所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的引物系统。5.如权利要求4所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、单碱基延伸试剂和毛细管电泳试剂中的至少一种。6.如权利要求4或5所述的单碱基延伸法检测UGT1A1*6基因多态性用的试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：甘立佳，胡昌明，刘晶星，徐艳艳，海洋，王春晖，于世辉，
申请(专利权)人：广州金域医学检验集团股份有限公司，广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44