SARS病毒的基因检测试剂盒及检测方法技术

一种ＳＡＲＳ病毒的基因检测试剂盒及检测方法，以ＳＡＲＳ病毒特异性核酸定量标准品为对照，包括ＲＮＡ提取，聚合物酶链反应（ＰＣＲ）扩增及荧光检测，所述的检测方法直接用待测病人的静脉血标本或漱口液或呼吸道分泌物为分析样本，提取出样本中的ＲＮＡ作为核酸模板，再对核酸模板进行荧光聚合物酶链反应扩增，所用的荧光扩增检测试剂包括一步法ＲＴ－ＰＣＲ缓冲液、脱氧三磷酸核苷（ｄＮＴＰ）混合物、及特异扩增引物及特异探针。这种检测方法快捷，方便，能够尽快确诊病人的分泌物或血液中是否存在ＳＡＲＳ病毒，有效减少ＳＡＲＳ病毒在人群中传播。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种的基因检测试剂盒及用该试剂盒检测样品中是否含有SARS病毒的基因检测方法。
技术介绍
非典型肺炎是一种急性呼吸道传染病，国外称其为重症急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，简称为SARS。主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播，起病急、传播快，病死率超过于5％。从2002年11月我国广东省出现第一个病例开始，短短半年时间，目前涉及到世界近30个国家和地区，全球患者已达6000多例，且发病人数仍有不断增加的趋势。由于其通过近距离空气飞沫和密切接触传播，目前还没有疫苗及特效的药物，多数人对SARS没有免疫力，切断传源就成了阻断SARS传播重要方法。但是目前的几项临床诊断标准，总要在SARS病人发病甚至病重后才能被确诊。这显然很不利于控制疫情。寻找一个能迅速准确诊断SARS的方法至关重要。2003年4月16日，世界卫生组织在瑞士日内瓦宣布，经过全球10个国家和地区13个实验室的通力合作，在全球多个国家快速传染的非典型肺炎，英文名称为SARS，的病原体最终被确认。这是一种冠状病毒，SARS病原体完整的基因组被破解。它是由加拿大科学家在4月12日首先宣布的，几天后，美国疾病控制中心也作了类似的宣布。加拿大范库弗迈克·史密斯基因组科学中心的研究人员破译了这种病毒的基因图谱。SARS的病原体的发现及这种病毒基因图谱的破译，使得寻找一个快速准确的能检测SARS病毒的基因诊断方法成为可能。近年来迅速展起来的荧光PCR技术是人PCR技术(聚合酶链式反应技术)基础上发展起来的，可以从核酸水平上检测病毒。荧光PCR技术对PCR产物的检测原理做了很大的改进，可动态实时监测核酸产物的形成，无须后处理过程，这样在一定程度上避免了扩增产物的污染，既缩短了检测时间，又节省了特殊仪器及专业人员的配备。荧光PCR技术的原理荧光PCR不同于其它PCR之处在于利用荧光染料在激发光的作用下所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变化。因荧光信号变量与扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器对荧光的采集与分析来实现对初始模板的定量。荧光染料的引入有以下几个途径直接结合核酸产物、标记引物或标记特异性探针，而荧光标记的探针共有三类(1)分子信标探针；(2)杂交双探针；(3)Taqman双标记探针。在PCR反应体系中除常规一对引物外，另有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5’端与3’端分别标记上不同的荧光基团，探针5′端标记一报告荧光基团(reporter，R)，3′端标记一淬灭荧光基团(quencher，Q)，当探针保持完整时，5’端荧光基团R吸收光能后会将能量转移给临近3’端荧光淬灭基团Q，其Q基团抑制了R基团的荧光信号，该检测，5’所以正常情况下检测系统将不能检测到该探针5’端荧光基团所发出的荧光信号。但在PCR延伸反应过程中，DNA聚合酶(Taq)的5’-3’外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，(仪器检测出荧光值出峰的最低循环数(cycle threshold，Ct)与检测病毒核酸量对数值呈线性负相关)，因而根据荧光PCR反应中的荧光Ct值)就能算出原始的模板量。本专利技术就是根据上述原理，设计适合SARS病毒的特异性引物和特异性探针，专利技术目的在于提供一种能快速准确检测SARS病毒的基因检测试剂盒及基因检测方法，从而快速诊断病人是否携带SARS病毒并可测出病毒的数量。
技术实现思路
为实现本专利技术目的，解决无法快速准确诊断病人的血液及呼吸道分泌物样品中SARS的病毒是否存的检测试剂及检测方法。为此，本专利技术采取以下技术方案一种SARS病毒的基因检测试剂盒，包括SARS病毒特异性核酸定量标准品，即SARS的部分序列5’TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC-3’所述的试剂盒还包括以下组分(1)荧光扩增检测试剂由一步法RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物、特异性扩增引物及特异性探针以蒸馏水为溶剂混合而成，所述的特异性引物是引物S1引物序列为5′-CCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTT-3′引物S2引物序列为5′-GTTAGTACCCACAGCATCTCTAGTT-3′所述的特异性探针是 探针S3探针序列为5′-R-AGCCCTCTACATCAAAGCCAATCCACGC-Q-3′R为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。(2)DNA聚合酶(3)防止污染的尿嘧啶糖基酶(UNG)；(4)用于逆转录的逆转录酶。所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，所述的荧光扩增检测试剂由下列组分以蒸馏水为溶剂混合而成一步法RT-PCR缓冲液 含量体积百分比10％脱氧三磷酸核苷(dNTP混合物 含量100-300μM特异性引物S1 含量0.05-1.5μM特异性引物S2 含量0.05-1.5μM特异性探针S3 含量0.05-1.0μM余量为蒸馏水本专利技术是SARS病毒PCR荧光定量检测试剂，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合技术，对SARS病毒的特异性RNA核酸片段进行荧光定量检测。该试剂适用于对血液和脱落细胞(上呼吸道，泌尿道)中的SARS病毒的特异性RNA核酸片段进行荧光的检测。该检测试剂的核心是荧光扩增检测试剂中针对SARS病毒的特异性引物和探针，SARS特异性核酸定量标准品。特异性引物S1，S2；特异性探针S3。SARS特异性核酸定量标准品核心是一段SARS病毒特异性核酸序列。特异性探针S3是TaqMan聚合酶链反应技术(TaqMan-PCR)的核心，该探针5′端标记一报告荧光基团(reporter，R)，3′端标记一淬灭荧光基团(quencher，Q)。报告荧光R基团有FAM(羧基荧光黄)，HEX(6-氯荧光黄)，TAMARA(四甲-6羧罗丹明)，CY3(吲哚二羧菁)，CY5(吲哚二羧菁)，ROX(6-羧-X-罗丹明)；淬灭基团Q有TAMARA(四甲-6羧罗丹明)，BHQ，DABSYL(二甲氨基偶氮苯甲酰基)。报告荧光基团R及淬灭基团Q可以根据方便选用。TaqMan聚合酶链反应技术(TaqMan-PCR)是一种最新的荧光定量基因扩增技术之一。大多数Taq酶不仅有5′→3′DNA聚合酶活性，能在引物的引导下延伸DNA链，还具有5′→3′外切酶活性，荧光定量基因分析法就是巧妙地运用了Taq酶的这两种酶活性而发展起来的。在扩增反应体系中加入一条与待扩增的目的片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＳＡＲＳ病毒的基因检测试剂盒，包括ＳＡＲＳ病毒特异性核酸定量标准品，即ＳＡＲＳ的部分序列： ５’－ＴＡＣＣＧＴＡＧＡＣＴＣＡＴＣＴＣＴＡＴＧＡＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＡＡＴＧＡＡＴＴＡＣＣＡＡＧＴＣ ＡＡＴＧＧＴＴＡＣＣＣＴＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＣＧＴＣＡＣＧＴＴ ＣＧＴＧＣＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣ ＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＴＡＡＣＴＴ ＡＧＴＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＡＣＴＧＧＴＴＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＡＡＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡ ＣＣＡＧＡＧＴＴＡＡＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴＴＡＴＡ ＣＣ－３’ 其特征在于所述的试剂盒还包括以下组分： （１）荧光扩增检测试剂：由一步法ＲＴ－ＰＣＲ缓冲液、脱氧三磷酸核苷（ｄＮＴＰ）混合物、特异扩增引物及特异探针以蒸馏水为溶剂混合而成，所述的特异性引物是： 引物Ｓ１：引物序列为５’－ＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＧＧＴＴＡＣＣＣＴＡＡＴＡＴＧＴＴ－３’ 引物Ｓ２：引物序列为５’－ＧＴＴＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＡＧＴＴ－３’ 所述的特异性探针是： 探针Ｓ３：探针序列为５’－Ｒ－ＡＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＣＧＣ－Ｑ－３’ Ｒ为报告荧光基团，Ｑ为淬灭荧光基团。 （２）ＤＮＡ聚合酶 （３）防止污染的尿嘧啶糖基酶（ＵＮＧ）； （４）用于逆转录的逆转录酶。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李兰娟，姜汉卿，沃健儿，吴南屏，邵俊斌，麻静明，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，杭州博赛基因诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]