本发明专利技术涉及一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时本发明专利技术还涉及腺苷脱氨酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷、单价磷酸盐、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶、稳定剂、还原型色原体组合，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况（速度），从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。采用本发明专利技术完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时本专利技术还涉及用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，属于医学检验测定
技术介绍
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是腺苷(白色结晶粉末)+水(H2O)腺苷脱氨酶肌苷(Inosine)+氨离子(NH4+)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。检索发现，申请号为03128092.7、申请日为2003.05.29、名称为《一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法》的中国专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰氨辅酶配制的测定试剂。该专利技术所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰氨辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰氨辅酶或其类似物，及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰氨辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰氨辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该专利技术所指的酶法试剂就可达到测定样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。该专利技术的特点在于为腺苷脱氨酶的测试提供一个内源合成腺苷脱氨酶反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的腺苷脱氨酶试剂。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分腺苷脱氨酶试剂(腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶反应必定将还原型烟酰氨辅酶氧化成氧化型烟酰氨辅酶)的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的腺苷脱氨酶活性的测定方法，同时给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术测定腺苷脱氨酶活性的方法步骤如下1)、将样品与主要由腺苷、单价磷酸盐、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子肌苷+单价磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢尿酸盐+水+氧脲酶尿曩素+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水2)、检测最终反应物在主波长主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长400--600nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处直接反映吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)含量高低的光吸收大小，得出腺苷脱氨酶测定结果。以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。本专利技术通过腺苷脱氨酶、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、脲酶、过氧化物酶等一系列的酶偶联反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的吲嗒胺色原或醌亚胺色原，从而可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长400--600nm处，测定吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量的高低，进而直接反映出腺苷脱氨酶活性的大小，为多种疾病的诊断提供方便，整个测定过程只需按步骤加入试剂即可，一气呵成，便于操作。与现有技术相比，本专利技术不仅便于推广应用，试剂反应生成二倍过氧化氢，理论上灵敏度提高二倍。而且由于所生成的吲嗒胺色原或醌亚胺色原均有较高的摩尔消光系数，因此灵敏度高、精确度好。用以实现本专利技术方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液40--200mmol/l腺苷 1--50mmol/l单价磷酸盐0.2--10mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黄嘌呤氧化酶 500--50000U/l过氧化物酶500--50000U/l脲酶 500--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)还原型色原体组合 0.1--20mmol/l还原型色原体组合可以是0.5-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone简称MBTH)或0.5-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine，AAP)与0.1--20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine简称ESPAS)N，N-双乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-双氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid简称TBHB)3，5-双氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenol sulfonic acid)3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonic acid简称DHBS)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine-sodium简称TOOS) 仨溴羟基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)双甲基苯胺(Dimethylaniline简称DMA)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine简称EHSPT)2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)简称ABTS4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)简称HMB)3-甲基-乙基-羟基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline简称MEHA)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源肌苷、次黄嘌呤及尿酸的污染试剂I缓冲液40--200mmol/l单价磷酸盐0.2--10mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黄嘌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，步骤如下：１）、将样品与主要由腺苷、单价磷酸盐、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、脲酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下反应：腺苷＋水腺苷脱氨酶肌苷＋氨离子肌苷＋ 单价磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤＋１－磷酸核糖次黄嘌呤＋水＋氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐＋过氧化氢尿酸盐＋水＋氧脲酶尿曩素＋过氧化氢过氧化氢＋还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原＋水 ２）、检测最终反应物在主波长主波长４００－－６００ｎｍ吸光度上升的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：王尔中，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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