本发明专利技术涉及一种测定血氨含量的方法，同时本发明专利技术还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷三磷酸、谷氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶、丙酮酸激酶、谷氨酰胺合成酶、乳酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况（速度），从而测算出血氨的含量。采用本发明专利技术完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定血氨含量的方法，同时本专利技术还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定
技术介绍
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％——13％；离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％——4.8％，回收率高，但均需专门的仪器，不适合我国的具体实际。检索中国专利，仅查出87105593.7号专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的血氨含量的测定方法，同时给出用以实现本专利技术方法的血氨诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行血氨含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术测定血氨含量的方法步骤如下 1)、将样品与主要由腺苷三磷酸、谷氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶、丙酮酸激酶、谷氨酰胺合成酶、乳酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+氧化型辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出血氨的含量。通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出血氨的含量。以上样品与试剂的混合比例为按体积1/10到1/100，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。本专利技术应用谷氨酰胺合成酶偶联丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶反应比色法。谷氨酰胺合成酶利用氨、谷氨酸、腺苷三磷酸合成谷氨酰胺，反应的副产物腺苷二磷酸再和磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下最后产生丙酮酸，再通过偶联乳酸脱氢酶的作用，氧化NAD(P)H成为NAD(P)+，从而得以测定NAD(P)H在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算氨含量的多少。本专利技术的血氨诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40——200mmol/l 腺苷三磷酸1——10mmol/l谷氨酸1——20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——5mmol/l还原型辅酶0.2——0.3mmol/l丙酮酸激酶4000——20000U/l谷氨酰胺合成酶4000——20000U/l乳酸脱氢酶10000——50000U/l稳定剂10——80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源腺苷二磷酸、丙酮酸的污染试剂I缓冲液40——200mmol/l谷氨酸1——20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——5mmol/l还原型辅酶0.2——0.3mmol/l丙酮酸激酶4000——10000U/l谷氨酰胺合成酶4000——10000U/l乳酸脱氢酶10000——50000U/l稳定剂10——80％(总体积)试剂II缓冲液40——200mmol/l腺苷三磷酸1——10mmol/l稳定剂10——50mmol/l双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，谷氨酸可以放在试剂II，试剂II其中的成分，腺苷三磷酸也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，就不在此一一详述。还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源腺苷二磷酸、丙酮酸的污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液 40——200mmol/l谷氨酸 1——20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1——5mmol/l还原型辅酶 0.2——0.3mmol/l稳定剂 10——50mmol/l试剂II缓冲液 40——200mmol/l丙酮酸激酶 4000——10000U/l谷氨酰胺合成酶 4000——10000U/l乳酸脱氢酶 10000——50000U/l稳定剂 10——80％(总体积)试剂III缓冲液 40——200mmol/l腺苷三磷酸 1——10mmol/l稳定剂 10——50mmol/l三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，谷氨酸可以放在试剂II或试剂III中，试剂I的其他成分，磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II其中的成分，丙酮酸激酶、谷氨酰胺合成酶、乳酸脱氢酶等也可以放在试剂I中，试剂III的成分，腺苷三磷酸可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，就不在此一一详述。缓冲剂的pH范围可以是7.0-11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10-80％或者10-50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺、盐或腺苷二磷酸等中的一种或一种以上。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本专利技术血氨诊断试剂盒较为理想缓冲液 80——120mmol/l腺苷三磷酸 2——8mmol/l谷氨酸 4——12mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1——5mmol/l还原型辅酶 0.2——0.3mmol/l丙酮酸激酶 6000——12000U/l谷氨酰胺合成酶 6000——12000U/l乳酸脱氢酶 10000——30000U/l稳定剂 10——50％(总体积)由于本专利技术是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。此外，本专利技术的显著特色之一是可以消除内、外源腺苷二磷酸、丙酮酸的污染，消除内、外源腺苷二磷酸、丙酮酸的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源腺苷二磷酸、丙酮酸已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试血氨含量所需要的腺苷二磷酸、丙酮酸都是产生于血氨的作用。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。实施例一(单剂)本实施例的血氨诊断试剂盒包括缓冲液 80mmol/l腺苷三磷酸 2mmol/l谷本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定血氨含量的方法，步骤如下： １）、将样品与主要由腺苷三磷酸、谷氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶、丙酮酸激酶、谷氨酰胺合成酶、乳酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下反应： 氨＋谷氨酸＋腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺＋腺苷二磷酸＋磷酸根 腺苷二磷酸＋磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸＋丙酮酸 丙酮酸＋还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸＋氧化型辅酶 ２）、检测最终反应物在主波长３４０ｎｍ吸光度下降的速度，测算出血氨的含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：王尔中，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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