本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨（离子）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定氨（离子）浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度，从而测算出氨（离子）的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定氨(离 子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用 最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler 反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造 成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散 法更准确，CV为8X 13X;离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引 起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5X 4.8X，回收率高。结 合具体实际，应以酶法测定为实用。检索中国专利，仅査出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯， 却未发现比较理想的血氨测定方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟 酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨(离子) 浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的氨(离子)诊断/测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进 行氨(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推 广应用。本专利技术氨(离子)浓度测定方法原理如下氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根 磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+ 二氧化碳+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)L-苹果酸+辅酶这种方法应用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶)联 丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase ; EC 1丄1.38; EC 1丄1.39; EC 1丄1.40; EC 1.1.1.83)酶促反应终点比色法。谷氨酰胺合成酶酶解氨(离子)反应产生磷酸根、腺苷二磷酸， 再通过(偶)联合丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶(脱羧化)的作用，最终将还 原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)， 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸 光度下降的程度，可以测算氨(离子)的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术氨(离子)诊断/测定试剂盒较 为理想缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L谷氨酰胺合成酶 6000 U/L丙酮酸羧化酶 8000 U/L苹果酸脱氢酶 10000 U/L谷氨酸 10mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L草酰乙酸 5 mmol/L丙酮酸 3 mmol/L本专利技术的氨(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、苹果 酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、丙酮酸。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、丙 酮酸。试剂2缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶。 还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸、腺 苷三磷酸、草酰乙酸、丙酮酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可 以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、丙 酮酸。试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶。试剂3缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶。 还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸、腺 苷三磷酸、草酰乙酸、丙酮酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定氨(离子)浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100 mmol/L稳定剂500 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L谷氨酰胺合成酶6000 U/L丙酮酸羧化酶8000 U/L苹果酸脱氢酶10000U/L谷氨酸10 mmol/L腺苷三磷酸3 mmol/L草酰乙酸5 mmol/L丙酮酸 3 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm,被测氨(离子)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间O分钟，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。 实施例二本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂l三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷三磷! 草酰乙酸丙酮!10Ommol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂谷氨酰胺合成酶100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L丙酮酸羧化酶 8000 U/L苹果酸脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。实施例三本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂l三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷三磷酸 草酰乙酸丙酮酸100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂丙酮酸羧化酶500 mmol/L 謂0 U/L苹果酸脱氢酶 10000 U/L试剂3三(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的氨（离子）浓度测定方法，其方法原理如下： 氨离子＋谷氨酸＋腺苷三磷酸 谷氨酰胺合成酶 谷氨酰胺＋腺苷二磷酸＋磷酸根 磷酸根＋腺苷二磷酸＋草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸＋丙酮酸＋二氧化碳 丙酮酸＋二氧化碳＋还原型辅酶 苹果酸脱氢酶（脱羧化） Ｌ－苹果酸＋辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度，测算出氨（离子）的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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