一种荧光检测半胱氨酸的试剂和方法技术

本发明专利技术提供了一种荧光检测半胱氨酸的试剂和方法。本发明专利技术提供的检测半胱氨酸的试剂，它是一种色烯衍生物MOPCC(7-methyl-1-oxo-1,2,3,3a-tetrahydrocyclopenta[b]chromene-5-carbaldehyde)。本发明专利技术提供的检测Cys的方法，是基于色烯衍生物MOPCC，在DMSO/HEPES(v/v,1:1,pH7.4)溶液中定量地检测半胱氨酸的含量。该检测方法，对半胱氨酸显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及半胱氨酸检测分析技术，具体涉及一种荧光检测半胱氨酸的试剂和方 法。
技术介绍
L-半胱氨酸（L-Cys)是20种天然氨基酸中唯一含有还原性基团巯基的氨基酸。作 为一种人体必需的氨基酸，Cys参与细胞内谷胱甘肽、蛋白质的合成，承担着解毒、消炎和抗 衰老的作用。同时，研究表明人体内非正常的Cys水平与儿童生长缓慢、肝损伤、皮肤损伤 及肌肉损伤等疾病有着密切的关系。快速、准确地检测样品中的Cys含量对于疾病诊断具 有极其重要的意义。目前，对Cys检测分析的方法主要有色谱法（张苏，王凤山.高效液相 色谱法测定酶促反应液中的L-半胱氨酸含量.中国生化药物，2009, 30 (5) : 318-320)、 光度法（陈亚红，李占灵，张会霞.酶抑制动力学光度法测定L-半胱氨酸.分析试 验室，2008, 27(1) :38-41)、电化学方法（Vandeberg, P. J.，Johnson, D. C. Comparison of pulsed amperometric detection and integrated volatmmetrc detection for inorganic sulfur compounds in liquid chromatography. Anal. Chim. Acta, 1994, 290, 317-327 ；Maleki, N. , Safavi, A. , Sedaghati, F. , et al. Efficient electrocatalysis of L-cysteine oxidation at carbon ionic liquid electrode. Anal. Biochem, 2007, 369:149-153)。然而，这些检测方法程序繁琐、设备昂贵，且无法用于 细胞内Cys的检测。所以，发展新的过程简单、精度高、成本低、适用性广的检测Cys的方法 非常必要。 本专利技术中，我们合成了一种色烯化合物M0PCC，基于Cys与化合物的"点击"开环反 应引起的荧光变化，实现对Cys的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种合成简单，选择性高，适用性广的定量检测Cys的试剂， 以及该试剂在Cys检测中的应用。 本专利技术提供的检测Cys的方法，是基于一种色稀衍生物M0PCC(7-methyl-l_ox 〇-1, 2, 3, 3a-tetrahydrocyclopentachromene-5-carbaldehyde),在 DMS0/HEPES(v/ V, I: I, pH 7. 4)溶液中定量地检测Cys。该检测方法对Cys显示了优良的灵敏性和选择性， 检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。 MOPCC 的合成：取 pyridinium chlorochromate (PCC) (2mmol, 0· 42g)分散于 20mLdichloromethane 中，将 5-(hydroxymethyl)-7-methyl_3, 3a_dihydrocyclopenta chromen-l(2H)-〇ne(HMMPC) (2mmol，0.46g)逐渐加入体系。室温搅拌20h后，减压蒸干溶 剂，粗产品经柱色谱分离（ethyl acetate:petroleum= 1:1)得到黄色纯品。 CN 105181666 A 说明书 2/3 页 MOPCC检测Cys的方法，步骤为： (1)、配制pH = 7. 4、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，配制2mM MOPCC的DMSO溶 液，配制2mM Cys的水溶液； (2)、按体积比 40:1，将 DMSO/HEPES (v/v, 1: 1，pH 7. 4)和 MOPCC 的 DMSO 溶液加到 干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样Cys的加入，515nm的荧光强 度逐渐增强； (3)、取 2mL 的 DMSO/HEPES (v/v, 1: 1，pH 7. 4)溶液、50 μ LMOPCC 的 DMSO 溶液加到 另一个荧光比色皿中，分别加入体积为5、10、15、20、25、30、35、40、45yL的Cys溶液时，在 荧光分光光度仪上测定515nm对应的荧光强度F为761、1128、1410、1764、2047、2311、2598、 2904、3027,以Cys浓度为横坐标，以相对荧光强度F - F。为纵坐标绘制图，F。= 328,得到 Cys浓度的工作曲线；线性回归方程为：F - F。= 62. 12C+120. 4, c的单位为μΜ ; (4)、取 2mL 的 DMSO/HEPES (v/v, 1: 1，pH 7. 4)溶液、50 μ LMOPCC 的 DMSO 溶液加入 荧光比色皿中，用微量进样器吸取V μ L待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在 荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入（3)的线性回归方程，得到浓度C，待测样 品C待测样=2000 X c X 10 6/V，单位Μ。 与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1、检测体系成本低廉，试剂由本课题 组之前报道的HMMPC和PCC在室温下制得，原料便宜，反应条件简单，易于大规模生产；2、本 专利技术的检测方法对Cys显示出高的选择性和灵敏性，其它氨基酸对Cys的测定没有干扰；3、 检测过程在水溶液中进行；4、检测手段简单，只需要借助荧光分光光度仪即可实现。【附图说明】： 图1实施例1M0PCC与Cys作用的荧光发射图 图2实施例2M0PCC与各种分析物的荧光柱状图 图3实施例3测定Cys的工作曲线 图4实施例4测定样品的荧光发射图 图5a MOPCC氢谱表征 图5b MOPCC碳谱表征 图5c MOPCC质谱表征【具体实施方式】： 实施例1 配制pH = 7. 4、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，配制2mM MOPCC的DMSO溶液，配 制 2mM Cys 的水溶液；取 2mL 的 DMSO/HEPES (v/v, 1: 1，pH 7. 4)溶液、50 μ LMOPCC 的 DMSO 溶 液加到一个荧光比色皿中，取Cys的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在 焚光分光光度仪上检测（365nm激发），随着Cys的加入，515nm处焚光强度逐渐增强。焚光 发射图见图1。 实施例2 配制pH = 7. 4、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，配制2mM MOPCC的DMSO溶液，配 fjjij 2mM Cys, Ala, Arg, Hey, GSH, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Ser, Thr, Trp，Phe，Pro, Tyr，Val的水溶液；在22个荧光比色皿中，各加入2mL的DMS0/HEPES(v/ V，1: 1，pH 7. 4)溶液、50 μ LMOPCC的DMSO溶液，再分别加入1摩尔当量的Cys，以及5摩尔 当量的各种分析物：Cys，Ala，Arg，Hcy，GSH，Asn，Asp，Gln，Glu，Gly，His，lie，Leu，Lys， Met，Ser，Thr，Trp，Phe，Pro，Tyr，Val在焚光分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测半胱氨酸的试剂：特征在于它是一种色烯衍生物，名称为7‑methyl‑1‑oxo‑1,2,3,3a‑tetrahydrocyclopenta[b]chromene‑5‑carbaldehyde，缩写为MOPCC。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：岳永康，阴彩霞，霍方俊，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14