本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的镁（离子）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定镁（离子）浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、乙酰磷酸、己糖激酶、乙酸激酶、醛脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的速度，从而测算出镁（离子）的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定镁(离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
镁测定方法很多，概括起来有比色法、荧光法、离子层析法，离子选择性电极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。镁测定的决定性方法是同位素稀释质谱法，参考方法是原子吸收分光光度法法。这些方法虽然结果准确，但设备复杂，费用昂贵，不适合常规实验室和自动分析。比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、邻甲酚酞络合酮法(0CPC)、钙镁试剂(Calmagite)法、以及新近报道的2_ (8，-羟基喹啉_5，-磺酸_7，-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)法。比色法操作简便，费用低，适合常规实验室应用。但存在试剂空白吸光度高，胆红素和其它阳离子的干扰，试剂稳定性差及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。离子选择性电极法可测定生理溶液中镁离子活度。采用中性载体(ETH7025)液膜离子选择电极测定准确度较高。但还存在钙干扰(生理范围内)Ca2+最大干扰10%等不足。离子色谱法测定血清总镁在测定之前需对样本进行预处理，包括酸化稀释4和过滤。Thienpont等使用该法对五种国际标准和技术学会用火焰原子吸收分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35%,认为离子色谱法可作为总镁测定有价值的参考方法。Mg2+的酶法测定技术在近几年研究非常活跃，取得较大进展。己应用于Mg"测定的酶学方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联法。酶法检测镁结果准确，干扰影响小，适合于自动化分析。由于酶试剂不断更新，使测定快速、灵敏，操作简便，因而具有较好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetricMethod)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定镁(离子)浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的镁(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行镁(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术镁(离子)浓度测定方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶/Mg"葡萄糖-6-磷酸+腺苷二磷酸腺苷二磷酸+乙酰磷酸乙酸激酶乙酸+腺苷三磷酸乙酸+还原型辅酶醛脱氢酶 乙醛+辅酶+水这种方法应用需要镁离子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7丄1; EC 2.7丄2)酶(偶)联乙酸激酶(acetate kinase; EC 2.7.2.1)、醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase; EC 1.2.1.3; EC 1.2.1.4; EC 1.2.1.5)酶促反应连续监测/速率比 色法。在镁离子的激活下，己糖激酶酶解腺苷三磷酸反应产生腺苷二磷酸，再 通过(偶)联合乙酸激酶、醛脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处 有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅 酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以 测算镁(离子)的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术镁(离子)诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液100mmol/L稳定剂500醒ol/L还原型辅酶0.25 mmol/L己糖激酶6000 U/L乙酸激酶8000 U/L醛脱氢酶10000U/L葡萄糖20 mmol/L腺苷三磷酸3 mmol/L乙酰磷酸3 mmol/L本专利技术的镁(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括:缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、乙酸激酶、醛脱氢酶、葡萄 糖、腺苷三磷酸、乙酰磷酸。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、乙酰磷酸。试剂2缓冲液、稳定剂、己糖激酶、乙酸激酶、醛脱氢酶。 还原型辅酶、己糖激酶、乙酸激酶、醛脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、乙酰 磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、乙酰磷酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、乙酸激酶、醛脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、己糖激酶。 还原型辅酶、己糖激酶、乙酸激酶、醛脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、乙酰 磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定镁(离子)浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。实施例一本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100mmol/L稳定剂500 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L己糖激酶6000 U/L乙酸激酶8000 U/L醛脱氢酶10000U/L葡萄糖20 mmol/L腺苷三磷酸3 mmol/L乙酰磷酸3 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂的 体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右， 检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小 实施例二本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷三磷酸乙酰磷酸廳mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂己糖激酶乙酸激酶500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂1、 试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2 分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的镁（离子）浓度测定方法，其方法原理如下： 葡萄糖＋腺苷三磷酸 己糖激酶／Ｍｇ↑［２＋］ 葡萄糖－６－磷酸＋腺苷二磷酸 腺苷二磷酸＋乙酰磷酸 乙酸激酶 乙酸＋腺苷三磷酸 乙酸＋还原型辅酶 醛脱氢酶 乙醛＋辅酶＋水 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的速度，测算出镁（离子）的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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