本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的镁（离子）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定镁（离子）浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化铵、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的速度，从而测算出镁（离子）的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定镁(离 子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
镁测定方法很多，概括起来有比色法、荧光法、离子层析法，离子选择性电极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。镁测定的决定性方法是同位素稀释质谱法，参考方法是原子吸收分光光度法 法。这些方法虽然结果准确，但设备复杂，费用昂贵，不适合常规实验室和自 动分析。比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、 邻甲酚酞络合酮法(0CPC)、钙镁试剂(Calmagite)法、以及新近报道的2- (8， -羟基喹啉-5，-磺酸-7，-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)法。比色法操作简便，费 用低，适合常规实验室应用。但存在试剂空白吸光度高，胆红素和其它阳离子 的干扰，试剂稳定性差及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。离子选择性电极法可测定生理溶液中镁离子活度。采用中性载体(ETH7025) 液膜离子选择电极测定准确度较高。但还存在钙干扰(生理范围内)Ca2+最大干 扰10%等不足。离子色谱法测定血清总镁在测定之前需对样本进行预处理，包括酸化稀释和过滤。Thienpont等使用该法对五种国际标准和技术学会用火焰原子吸收分 光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35%，认为离子色谱法 可作为总镁测定有价值的参考方法。Mg2+的酶法测定技术在近几年研究非常活跃，取得较大进展。已应用于Mg" 测定的酶学方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、 磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶 联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法; ⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联法。酶法检测镁结果准 确，干扰影响小，适合于自动化分析。由于酶试剂不断更新，使测定快速、灵 敏，操作简便，因而具有较好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，监测还原型烟 酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定镁(离子) 浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的镁(离子)诊断/测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进 行镁(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推 广应用。本专利技术镁(离子)浓度测定方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶^^+葡萄糖-6-磷酸+腺苷二磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸+水+辅酶这种方法应用需要镁离子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7.1.1; EC 2.7丄2)酶(偶)联丙酮酸激酶(pyruvic kinase; EC 2.7丄40)、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase; EC 1.4丄1)酶促反应逢续监测/速率比色法。在镁离子的激活下， 己糖激酶酶解腺苷三磷酸反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合丙酮酸激酶、 丙氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅 酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nrn处吸光度下 降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算镁(离子)的浓度 大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术镁(离子)诊断/测定试剂盒较 为理想缓冲液100mmol/L稳定剂500 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L己糖激酶6000 U/L丙酮酸激酶8000 U/L丙氨酸脱氢酶10000U/L葡萄糖20 mmol/L腺苷三磷酸3 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸 3 mmol/L氯化铵 3 mmol/L本专利技术的镁(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化铵。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙 酮酸、氯化铵。 试剂2缓冲液、稳定剂、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶。 还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、氯化铵在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙 酮酸、氯化铵。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶。试剂3缓冲液、稳定剂、己糖激酶。 还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、氯化铵在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试 剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定镁(离子)浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。实施例一本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100 mmol/L稳定剂500 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L己糖激酶6000 U/L丙酮酸激酶8000 U/L丙氨酸脱氢酶10000 U/L葡萄糖20 mmol/L腺苷三磷酸3 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸3 mmol/L氯化铵3 mmoI/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂的 体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右， 检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。 实施例二本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷三磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸氯化铵画mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂己糖激酶100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L10丙酮酸激酶8000 U/L 10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的镁（离子）浓度测定方法，其方法原理如下： 葡萄糖＋腺苷三磷酸 己糖激酶／Ｍｇ↑［２＋］ 葡萄糖－６－磷酸＋腺苷二磷酸 腺苷二磷酸＋磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶 腺苷三磷酸＋丙酮酸 丙酮 酸＋氨离子＋还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 Ｌ－丙氨酸＋水＋辅酶 其中，氨离子可以用氯化铵或其他铵盐代替。 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的速度，测算出镁（离子）的浓度大 小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。