本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨（离子）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定氨（离子）浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸、谷氨酰胺合成酶、乙酸激酶、醛脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度，从而测算出氨（离子）的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定氨(离 子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用 最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler 反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造 成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散 法更准确，CV为8X 13X;离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引 起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5X 4.8X,回收率高。结 合具体实际，应以酶法测定为实用。检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯， 却未发现比较理想的血氨测定方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟 酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨(离子) 浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的氨(离子)诊断/测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进 行氨(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推 广应用。本专利技术氨(离子)浓度测定方法原理如下氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根 腺苷二磷酸+乙酰磷酸乙酸激酶乙酸+腺苷三磷酸 乙酸+还原型辅酶醛脱氢酶乙醛+辅酶+水 这种方法应用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶)联 乙酸激酶(acetate kinase; EC 2.7.2.1)、醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase; EC1.2丄3; EC 1.2丄4; EC 1.2丄5)酶促反应终点比色法。谷氨酰胺合成酶酶 解氨(离子)反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合乙酸激酶、醛脱氢酶的 作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处 没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过 测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算氨(离子)的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术氨(离子)诊断/测定试剂盒较 为理想缓冲液100 mmol/L稳定剂500 mmol/L还原型辅酶0.25讓ol/L谷氨酰胺合成酶6000 U/L乙酸激酶8000 U/L醛脱氢酶10000 U/L谷氨酸10 mmol/L腺苷三磷酸3 mmol/L本专利技术的氨(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、乙酸激酶、醛脱氢酶、 谷氨酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、乙酸激酶、醛脱氢酶。 还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、乙酸激酶、醛脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、 乙酰磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、乙酸激酶、醛脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶。 还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、乙酸激酶、醛脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、 乙酰磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定氨(离子)浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括-三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100 mmol/L稳定剂500 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L谷氨酰胺合成酶6000 U/L乙酸激酶8000 U/L醛脱氢酶10000U/L谷氨酸10 mmol/L腺苷三磷酸3 mmol/L乙酰磷酸5 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂的 体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，检测时间 5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小, 实施例二本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷三磷酸乙酰磷f100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂谷氨酰胺合成酶 乙酸激酶100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。实施例三本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂还原型辅酶腺苷三磷酸 乙酰磷酸 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂试剂3稳定剂谷氨酰胺合成酶50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L画mmol/L 500 mmol/L ,0 U/L 10000U/L三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L500 mmol/L6000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定氨(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测氨(离子)样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的氨（离子）浓度测定方法，其方法原理如下： 氨离子＋谷氨酸＋腺苷三磷酸 谷氨酰胺合成酶 谷氨酰胺＋腺苷二磷酸＋磷酸根 腺苷二磷酸＋乙酰磷酸 乙酸激酶 乙酸＋腺苷三磷酸 乙酸＋还原型辅酶 醛脱氢酶 乙醛＋辅酶＋水 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度，测算出氨（离子）的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。