一种CYP2C9和/或VKORC1基因多态性快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒含有下列组分：热启动taq DNA聚合酶、血液直接PCR缓冲液(10X)、引物对、探针对和UNG酶；简单、高效、安全：可对血液样本直接进行荧光PCR扩增，无需经过核酸提取和纯化等步骤，降低模板交叉污染的风险，避免了苯酚等有害试剂的使用；灵敏度高：可准确检出低至2μl血液样本，所需样本量少，特异性好：针对CYP2C9C430T、CYP2C9A1075C和VKORC1G‑1639A设计特异的引物和分型探针，可特异性扩增识别对应的多态性。

A rapid detection kit for CYP2C9 and / or VKORC1 gene polymorphisms

The invention discloses a kit for detection of CYP2C9 and / or VKORC1 gene polymorphism, the kit comprises the following components: hot start Taq DNA polymerase, blood PCR buffer (10X), and to probe and primers for UNG enzyme; simple, efficient and safe: can the blood sample direct fluorescent PCR amplification without nucleic acid extraction and purification steps, reduce the risk of cross contamination of the template, avoiding the use of phenol and other harmful reagents; high sensitivity: accurate detection of low to 2 l blood samples, a small amount of sample, good specificity for primer CYP2C9C430T, CYP2C9A1075C and VKORC1G 1639A design and specific type of probe polymorphism was amplified specifically by the corresponding recognition.

【技术实现步骤摘要】
一种CYP2C9和/或VKORC1基因多态性快速检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CYP2C9和/或VKORC1基因多态性快速检测试剂盒。
技术介绍
华法林(Warfarin)是新一代抗凝剂，通过竞争性对抗维生素K的作用，抑制肝细胞中凝血因子的合成，降低凝血酶诱导的血小板凝集反应，从而具有抗凝和抗血小板凝集功能。华法林作为第一个口服抗凝药，已被临床广泛用于多种疾病抗凝治疗，但是华法林的药理作用易受多种因素影响，个体差异大，治疗窗窄，半数有效量与半数致死量的INR水平仅仅相差1倍左右，即使很小的剂量变化可能导致出血等不良反应，因而剂量调整十分重要。临床研究证明CYP2C9和VKORC1基因多态性导致35～50％的患者对华法林反应存在个体差异，这类人群需要更低的起始剂量。2007年8月，美国FDA批准更新华法林的产品说明书，要求在警示信息中标明服用者的遗传差异将影响其对该药物的反应，同时提醒医生如果患者存在这两个基因的变异，在处方华法林时应该采用较低的初始剂量。因此，检测患者这两个基因的多态性情况能科学指导华法林的临床使用。人细胞色素酶P450(CYP2C9)是华法林的主要代谢酶，其常见等位基因型CYP2C9*2(C430T)、CYP2C9*3(A1075C)会导致该酶的活性下降，从而使药物活性成分在血液中停留时间延长。而维生素K环氧化物还原酶亚单位1(VKORC1)是华法林的主要作用靶点，其SNP位点G-1639A、C1173T和G3739A变异会显著增加患者对华法林的敏感性。其中G-1639A是目前研究的主要位点，在亚洲人群的分布频率约为7.59％。目前，针对CYP2C9和VKORC1基因多态性检测的方法有多种，主要包括DNA测序法、限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)、基因芯片法(Genechips)、液相芯片法、高分辨率熔解曲线法(HRM)、荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法成本少、通量高，但操作耗时长且灵敏度低，不适合临床快速检测；高分辨率熔解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难。而传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确分型；此外，血液样本通常需经过提取和纯化，获得核酸作为荧光定量PCR扩增模板，虽然提纯的核酸纯度较高，但繁琐的提纯步骤不仅可能造成样本间交叉污染，同时也容易导致核酸的损失，从而增加后续荧光定量PCR失败的风险。因此需要建立一种快速有效且可用于直接检测少量血液样本的CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种可用于血液直接检测CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，旨在解决现有技术对于血液进行荧光定量PCR扩增时，需要预先对血液进行核酸提取纯化处理，从而导致核酸大量损失、且增加交叉污染以及有毒试剂使用的问题，此外，还具有扩增效率和灵敏度高、特异性好的优点。实现上述目的的技术方案如下：一种检测CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒含有下列组分：热启动taqDNA聚合酶、血液直接PCR缓冲液(10X)、引物对、探针对和UNG酶；所述引物对为选自以下中的至少一组：针对CYP2C9C430T的SEQIDNO.1和SEQIDNO.4、针对CYP2C9A1075C的SEQIDNO.7和SEQIDNO.10，针对VKORC1G-1639A的SEQIDNO.13和SEQIDNO.16；所述探针为选自以下针对相应引物位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对CYP2C9C430T的SEQIDNO.22和SEQIDNO.19、针对CYP2C9A1075C的SEQIDNO.28和SEQIDNO.25，针对VKORC1G-1639A的SEQIDNO.34和SEQIDNO.31，探针的5'端和3'端标记有荧光基团所述血液直接PCR缓冲液(10X)包括有：100±1mMTris-HCL、500±5mMKCl、20±1mMMgCl2、50±5％甘油、25±1％DMSO、0.5±0.05％Tween-20，pH8.3±0.1。在其中一个实施例中，所述血液直接PCR缓冲液(10X)包括有100mMTris-HCL、500mMKCl、20mMMgCl2、50％甘油、25％DMSO、0.5％Tween-20，pH8.3。本专利技术的另一目的还在于提供上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)配置PCR反应体系，每个PCR体系包含下列组分：热启动TaqDNA酶、血液直接PCR反应液(10X)、引物对、探针对、dNTPs、UNG酶；并加入待测的人血液样品。(2)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：第一阶段：50℃2分钟UNG处理；第二阶段：95℃4分钟预变性；第三阶段：95℃15s，60℃35s，5个循环；第四阶段：95℃15s，60℃35s，40个循环。信号收集：第四阶段60℃时收集FAM和VIC信号。本专利技术所述检测试剂盒和检测方法具有至少以下优点：(1)简单、高效、安全：所用的血液直接PCR缓冲液，能使血液中DNA聚合酶抑制物变性(如：血红素、蛋白质和脂肪等)，降低对荧光PCR的抑制作用，增强DNA聚合酶活性，从而可对血液样本直接进行荧光PCR扩增，无需经过核酸提取和纯化等步骤，降低模板交叉污染的风险，避免了苯酚等有害试剂的使用；(2)灵敏度高：可准确检出低至2μl血液样本，所需样本量少；(3)特异性好：针对CYP2C9C430T、CYP2C9A1075C和VKORC1G-1639A设计特异的引物和分型探针，可特异性扩增识别对应的多态性，检测结果与金标准测序法100％一致；(4)检测速度快：整个检测过程仅需要90min；(5)污染小：检测过程均为闭管反应，且加入了UNG酶，防止PCR产物污染。附图说明图1为CYP2C9C430T位点纯合野生型(C/C)样品荧光定量PCR扩增曲线图；图2为CYP2C9C430T位点纯合突变型(T/T)样品荧光定量PCR扩增曲线图；图3为CYP2C9A1075C位点纯合野生型(A/A)样品荧光定量PCR扩增曲线图；图4为VKORC1G-1639A位点野生型(G/G)样品荧光定量PCR扩增曲线图；图5为VKORC1G-1639A位点纯合突变型(A/A)样品荧光定量PCR扩增曲线图；图6为CYP2C9C430T位点不同浓度纯合野生型(C/C)标准品的荧光定量PCR扩增曲线图；图7为实施例3不同引物和探针组合对CYP2C9C430T位点纯合野生型(C/C)样品进行平行PCR扩增荧光扩增曲线图；图8为实施例3不同引物和探针组合对CYP2C9C430T位点纯合突变型(T/T)样品进行平行PCR扩增荧光扩增曲线图；图9为实施例4中血液直接PCR反应液和普通PCR反应液对3例不同来源的人血液样本进行平行PCR扩增的荧光扩增曲线图。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术方法，下面结合优选实施例和附图对本专利技术作进一步的说明。本领域技术人员应当理解，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有下列组分：热启动taq DNA聚合酶、10X血液直接PCR缓冲液、引物对、探针对和UNG酶；所述引物对为选自以下中的至少一组：针对CYP2C9C430T的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4、针对CYP2C9A1075C的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10，针对VKORC1G‑1639A的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.16；所述探针为选自以下针对相应引物位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对CYP2C9C430T的SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.19、针对CYP2C9A1075C的SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.25，针对VKORC1G‑1639A的SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.31，探针的5'端和3'端标记有荧光基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有下列组分：热启动taqDNA聚合酶、10X血液直接PCR缓冲液、引物对、探针对和UNG酶；所述引物对为选自以下中的至少一组：针对CYP2C9C430T的SEQIDNO.1和SEQIDNO.4、针对CYP2C9A1075C的SEQIDNO.7和SEQIDNO.10，针对VKORC1G-1639A的SEQIDNO.13和SEQIDNO.16；所述探针为选自以下针对相应引物位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对CYP2C9C430T的SEQIDNO.22和SEQIDNO.19、针对CYP2C9A1075C的SEQIDNO.28和SEQIDNO.25，针对VKORC1G-1639A的SEQIDNO.34和SEQIDNO.31，探针的5'端和3'端标记有荧光基团。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述10X血液直接PCR缓冲液包括有：100±1mMTris-HCL、500±5mMKCl、20±1mMMgCl2、50±5％甘油、25±1％DMSO、0.5±0.05％Tween-20，pH8.3±0.1。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述10X血液直接PCR缓冲液包括有100mMTris-HCL、500mMKCl、20mMMgCl2、50％甘油、25％DMSO、0.5％Tw...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭璨璨，许嘉森，吴诗扬，刘苏燕，刘志明，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44