用于选择磷酸酶选择性抑制剂和非选择性磷酸酶抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种发现磷酸酶的选择性抑制剂的方法。因此，本发明专利技术提供用于筛选受试化合物以确定该化合物是否选择性或非选择性结合全磷酸酶的方法，包括:i)提供第一全磷酸酶，其中将所述全磷酸酶捕集/固定；ii)测试受试化合物结合至所述第一全磷酸酶的能力；iii)提供第二全磷酸酶，其中将所述第二全磷酸酶捕集/固定；iv)测试相同的受试化合物结合至所述第二全磷酸酶的能力；v)比较所述受试化合物对所述第一全磷酸酶的结合与所述受试化合物对所述第二磷酸酶的结合；其中选择性结合全磷酸酶的化合物将结合至所述第一全磷酸酶而非所述第二全磷酸酶；或将结合至所述第二全磷酸酶而非所述第一全磷酸酶；或者其中非选择性结合全磷酸酶的化合物将结合至所述第一全磷酸酶和所述第二全磷酸酶这二者。

A method for selecting phosphatase selective inhibitors and non selective phosphatase inhibitors

The present invention discloses a method for discovering selective inhibitors of phosphatase. Therefore, the invention provides for screening test compounds to determine whether the compounds including selective or non selective binding method, the phosphatase: I) provides the first full phosphatase, wherein the total phosphatase trap / fixed; ii) by the ability of test compounds the first full phosphatase bound to test; iii) to provide second the phosphatase, wherein the second phosphatase trap / fixed; IV) test the same test compounds the second phosphatase binding ability to V); by comparing the subjects of the second compounds with phosphatase binding compounds on the first and the total phosphatase test; the selective binding compounds all phosphatase will combine to the first and the second total non phosphatase phosphatase; or binding to the second total phosphatase but not the first full; Or the non selective combination of all phosphatase compounds will be combined with the two of the first total phosphatase and the second phosphatase.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于选择磷酸酶选择性抑制剂和非选择性磷酸酶抑制剂的方法本专利技术公开了一种发现磷酸酶的选择性抑制剂的方法。专利技术背景蛋白的可逆磷酸化事实上控制细胞和生物体功能的所有方面，允许细胞通过激酶和磷酸酶的拮抗作用适应突然的变化。因此，靶向磷酸化提供广泛的治疗切入点，并且激酶已经成为当今对超过3000种已批准的以及实验的药物的药学研究中最常见的药物靶点。然而，虽然靶向磷酸酶原则上应与激酶一样具有吸引力，但磷酸酶的治疗潜力被忽视。大部分蛋白磷酸化发生在丝氨酸和苏氨酸上，并且选择性的丝氨酸/苏氨酸去磷酸化通过几百种不同的二聚体或三聚体全酶来实现，这些全酶由仅仅几种的催化亚基之一和几百种不同的调节亚基之一组合装配而成(Heroes等人，FEBSJournal，280，584-595，2012)。出于多种原因，通常已经认为磷酸酶是无成药性的。例如，多种磷酸酶是低聚的。因此，抑制全酶如PP1c的催化部分导致对共享相同催化亚基的多种(例如几百种)全磷酸酶产生抑制，并且可能产生毒性。因为选择性是药物开发的一个重要特性，催化磷酸酶的多功能性已经导致它们被认为是无成药性的。其次，磷酸酶的调节亚基是固有无序的(Bollen等人,2010；Choy等人,2012a)并且因此难以表达且不稳定。在大约200种哺乳动物PP1(蛋白磷酸酶1)全磷酸酶中，仅有八种已经得到了结晶。因此缺乏全磷酸酶的结构信息，这意味着基于结构的药物设计不易于应用于这类酶。迄今，可获得结构信息的全磷酸酶仅包含来自调节亚基的短肽(少于大约100个氨基酸)(Ragusa:2010hd；；Choy等人,2014)并且这些较小的结构使得难以指导药物发现。此外，基于人工底物的底物水解的酶试验将主要导致发现一般非选择性的催化抑制剂。因此，需要开发一种一般策略和试验以选择性抑制磷酸酶，并且能够鉴定特定抑制剂，并由此鉴定具有治疗用途的药物。
技术实现思路
近来，已经展示了选择性抑制丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的可行性。发现公开于WO2014108520(MedicalResearchCouncil)的一些胍那苄(Guanabenz)(Tsaytler等人,Science,332,91-94,2011；Tsaytler和Bertolotti,FEBSJournal,280,766-770,2012)及其衍生物选择性抑制PPP1R15A/GADD34(“R15A”)——一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1的应激诱导型调节亚基，并且提出将其用于治疗与蛋白错误折叠应激相关联的疾病。同样地，胍那苄衍生物Sephin1(Das等人,2015)已经显示选择性抑制PPP1R15A/GADD34。因此已经提出将Sephin1作为与蛋白错误折叠应激相关联的疾病的治疗。其它衍生物已经公开于例如WO2016001389A1、WO2016001390A1和WO2014138298A1中，并且据报道具有相似活性。然而，需要改进的选择性试验以确认这些分子是否对R15A抑制是选择性的。已经偶然鉴定了磷酸酶的其它抑制剂。例如，环孢菌素A和FK506分别结合亲免蛋白、亲环蛋白和FKBP12，并且所得复合物结合钙调磷酸酶——一种异源二聚磷酸酶，包含催化亚基PPP3和两种调节亚基PPP3R1或PPP3R2之一。环孢菌素A是一种磷酸酶抑制剂，但是它通过间接途径完成抑制：环孢菌素不以钙调磷酸酶全磷酸酶的调节亚基为靶标。已经报道了一种别构WIP1磷酸酶(Gilmartin等人,2014)。在酶试验中发现了这种抑制剂。迄今，无试验可用于鉴定选择性且别构的磷酸酶抑制剂。概括地说，虽然先前已经描述了磷酸酶抑制剂，重要的是注意到它们是偶然间被发现。无可用的方法用于普适地鉴定选择性磷酸酶抑制剂。一种用于鉴定选择性的且别构的磷酸酶抑制剂的方法包括靶向它们的调节亚基。已经偶然鉴定了R15A抑制剂并且提供了以下概念验证：丝氨酸-苏氨酸磷酸酶可通过靶向调节亚基而被选择性抑制(Das等人,2015；Tsaytler等人,2011)。原则上，相同的范例可用于选择性抑制多种其它PP1全磷酸酶中的一种。然而，磷酸酶的固有无序调节亚基的选择性抑制剂的理性发现是一个未解决的挑战。本专利技术提供一种试验方法，用于测定全酶如磷酸酶(即，全磷酸酶)的选择性结合。合适的全磷酸酶包括磷蛋白磷酸酶(PPP)超家族的成员，包括Ser/Thr蛋白磷酸酶1-7(PP1-7)，如例如(Heroes等人,FEBSJournal,280,584-595,2012)所综述。PPP1R15A(也称为GADD34并且本文称为“R15A”)和PPP1R15B(也称为CReP并且本文称为“R15B”)是PP1家族的全磷酸酶。因此，第一方面提供了用于筛选测试化合物以测定该化合物是否选择性地或非选择性地结合全磷酸酶的方法，所述方法包括：i)提供第一全磷酸酶，其中将所述全磷酸酶捕集/固定；ii)测试受试化合物结合至所述第一全磷酸酶的能力；iii)提供第二全磷酸酶，其中将所述第二全磷酸酶捕集/固定；iv)测试相同的受试化合物结合至所述第二全磷酸酶的能力；v)比较所述受试化合物对所述第一全磷酸酶的结合与所述受试化合物对所述第二磷酸酶的结合其中选择性结合全磷酸酶的受试化合物将结合至所述第一全磷酸酶而非所述第二全磷酸酶；或者将结合至所述第二全磷酸酶而非所述第一全磷酸酶；或者其中非选择性结合全磷酸酶的化合物将结合至所述第一全磷酸酶和所述第二全磷酸酶这二者。合适地，依次测试受试化合物结合第一全磷酸酶的能力和相同受试化合物结合第二全磷酸酶的能力，例如使用如本文详述使用单独的芯片、小珠或反应混合物进行测试，分别测定受试化合物对各全磷酸酶的结合亲和力用于比较。在一个实施方案中，全磷酸酶，即，上述第一和/或上述第二全磷酸酶，是一种低聚酶，包含一个催化亚基和一个或多个调节亚基。存在超过400种磷酸酶，它们实际上调控细胞功能的所有方面，这综述于例如Heroes等人(2012)。存在超过200种调节亚基，它们共享一些催化亚基。磷酸酶的调节亚基是固有无序的，即，天然非结构化的(Bollen等人，2010；Choy等人，2012a)，并且仅在结合至它们的催化亚基时趋于变得结构化。此前尚未提供用于鉴定此类天然非结构化分子的抑制剂的方法，因为开发此类方法通常是成问题的。当单独使用时(标记的或未标记的)，天然非结构化的磷酸酶的调节亚基一般不稳定或沉淀。因此，单独使用调节亚基从未使得相关生物活性的化合物可被鉴定。本专利技术方法使包含调节亚基的复合物(它们是天然非结构化的蛋白)当结合至它们的相互作用伴侣时，能够产生并用于筛选，从而允许新药靶向这类待鉴定的蛋白。合适地，通过任何可用的方法分离并纯化全磷酸酶。全磷酸酶能够例如在一个合适的表达系统中被表达为亚基，例如细菌、昆虫或哺乳动物细胞表达系统。可通过任何合适的方法例如色谱法纯化亚基。因为，如上所述全磷酸酶的调节亚基是固有无序的，可能需要用于表达和纯化的特定方法。因此，在一个实施方案中，可标记调节亚基以促进表达和纯化。合适地，调节亚基可标记有两个标签。合适的标签将是本领域内的技术人员熟悉的，并且包括例如亲和标签如麦芽糖结合蛋白(MaltoseBindingProtein)-标签、组氨酸-标签等。在一个具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于筛选受试化合物以确定所述化合物是否选择性或非选择性结合全磷酸酶的方法，包括： i) 提供第一全磷酸酶，其中将所述全磷酸酶捕集/固定；ii) 测试受试化合物结合至所述第一全磷酸酶的能力；iii) 提供第二全磷酸酶，其中将所述第二全磷酸酶捕集/固定；iv) 测试相同的受试化合物结合至所述第二全磷酸酶的能力；v) 比较所述受试化合物对所述第一全磷酸酶的结合与所述受试化合物对所述第二磷酸酶的结合；其中选择性结合全磷酸酶的化合物结合至所述第一全磷酸酶而非所述第二全磷酸酶；或结合至所述第二全磷酸酶而非所述第一全磷酸酶；或者其中非选择性结合全磷酸酶的化合物结合至所述第一全磷酸酶和所述第二全磷酸酶这二者。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.08 GB 1505975.1;2015.04.08 GB 1505971.01.一种用于筛选受试化合物以确定所述化合物是否选择性或非选择性结合全磷酸酶的方法，包括：i)提供第一全磷酸酶，其中将所述全磷酸酶捕集/固定；ii)测试受试化合物结合至所述第一全磷酸酶的能力；iii)提供第二全磷酸酶，其中将所述第二全磷酸酶捕集/固定；iv)测试相同的受试化合物结合至所述第二全磷酸酶的能力；v)比较所述受试化合物对所述第一全磷酸酶的结合与所述受试化合物对所述第二磷酸酶的结合；其中选择性结合全磷酸酶的化合物结合至所述第一全磷酸酶而非所述第二全磷酸酶；或结合至所述第二全磷酸酶而非所述第一全磷酸酶；或者其中非选择性结合全磷酸酶的化合物结合至所述第一全磷酸酶和所述第二全磷酸酶这二者。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和/或第二全磷酸酶是包含催化亚基和一个或多个调节亚基的低聚酶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述全磷酸酶是分离的和纯化的。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一和/或第二全磷酸酶的所述调节和/或催化亚基表达为具有2个标签以在2步过程中促进纯化。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述全磷酸酶的调节亚基为截短形式。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述全磷酸酶是重构的。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对受试化合物的结合能力的测试是通过使用表面等离子共振(SPR)法确定结合亲和力。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述全磷酸酶固定至表面。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述全磷酸酶通过在添加所述第一或第二调节亚基之前首先将所述催化亚基捕集至表面来重构。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述表面是适于SPR分析的芯片。11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中使用亲和力捕集方法将所述全磷酸酶固定。12.根据权利要求11所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：A伯托洛蒂，I达斯，A克齐佐西亚克，A鲁索，K施奈德，AG西古达多蒂尔，
申请(专利权)人：医疗研究局，
类型：发明
国别省市：英国,GB