GNRH（促性腺激素释放激素）肽衍生物制造技术

本申请涉及GNRH（促性腺激素释放激素）肽衍生物。本发明专利技术人发现，取代GnRH?I（促性腺激素释放激素）肽序列的位置5和／或7和／或8的氨基酸残基，以及特别地除去位置8的精氨酸残基可引起增强的抗增殖活性。而且，在GnRH?II肽序列的位置6引入一定的D-氨基酸残基可引起增强的抗增殖活性。这个令人惊奇的发现提供了用于治疗抗增殖性失调例如癌症的有力的和选择性的试剂。

【技术实现步骤摘要】
GNRH (促性腺激素释放激素)肽衍生物本申请是申请号为200780026537. 3，申请日为2007年5月I日，专利技术名称为“GNRH (促性腺激素释放激素)肽衍生物”的中国专利申请的分案申请。
本申请涉及用于药物的试剂、组合物和方法。特别地，本专利技术涉及与GnRH肽相关的试剂。
技术介绍
在人类中至少存在两种形式的促性腺激素释放激素(GnRH)。虽然对GnRH II的生物学作用知之甚少，但是我们知道GnRH I是哺乳动物繁殖的神经内分泌控制的中心调节子。从下丘脑神经元释放的GnRH I与垂体前叶(anterior pituitary)中的它的特异性的、G蛋白偶联受体(GPCR)相结合，最终促进促性腺激素的合成和释放(Kaiser等人，1997 ； Millar等人,2004)。GnRH另外还对垂体外组织(extra-pituitary tissues)和几种类型的癌症，特别是生殖系统癌症具有效应。在这些肿瘤中已经发现了激素的mRNA和受体，在体外和体内已经表明GnRH对细胞生长的直接的抑制(Limonta等人,2003和Grundker等人， 2002进行了综述)。对这个新型作用的研究是非常新的，产生了相反的数据收集。例如，在肿瘤细胞中发现两个不同的结合位点和药理学上不同的受体，这引起一些研究者建议第二种受体亚型(命名为II型，以与I型垂体受体相对)(Enomoto等人,2004 ；Grundker等人， 2004 ；Neill等人，2004)。但是，虽然在一些灵长类中已经克隆了 II型受体，但是在人类中还没有发现功能性替代亚型(Morgan等人，2003)。而且，在妇科癌症中发现的mRNA和cDNA 对应于I型受体(Limonta等人，2003)。GnRH调节其抗增殖作用的分子机制也是一个争论的问题。一些证据表明，不像垂体受体(其结合至Gq) (Grundker等人,2002 ；Limonta等人,2003),在肿瘤中表达的受体主要结合至Gi。其他待激活的多种细胞内途径已经被命名，包括生长因子作用的下调 (通过生长因子及其受体表达的减少和磷酸化酪氨酸磷酸酶的激活)、Akt和60s核糖体磷酸化蛋白的抑制(分别抑制细胞生存和蛋白合成)和几个促有丝分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases,MAPK)的激活(Grundker 2001 ;Chen等人，2002Kim 等人,2004b ;Kimura等人，1999 ;Kraus等人,2004Tanaka等人,2003)。细胞生长调节之上的 GnRH暴露的结果毫无疑问由细胞类型(规定细胞内的内容和类固醇激素对增殖的依赖性)、 治疗体制和其他的(有时为未明的)因素决定。GB 2，237，571A涉及促性腺激素释放激素类似物。Folkers等人(1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，82:1070-1074)涉及与促黄体化激素释放激素生物学等价的十肽。 Millar等人(1989，J. Biol. Chem. ,35:21007-21013)涉及脊椎动物促性腺激素释放激素的嵌合类似物。以前已经将GnRH肽用于治疗增殖性失调(通过调节垂体腺的激素释放)，例如癌症。但是，最近证明抗增殖也是配体的一个内在特性，其能够优先激活特定的信号级联反应，该事件被称为配体诱导的选择性信号传导的事件(LISS) (Maudsley等人，2004 ； Millar&Pawson，2004)。这解释了被刻画为拮抗剂的配体是如何通过相同的受体进行对其他细胞类型细胞的细胞生长抑制，因为他们不激活垂体受体。迄今为止，鉴定出极少的具有这些特性的配体。
技术实现思路
本专利技术人确定了与细胞生长抑制相关的GnRH I和GnRH II肽的结构性要求并令人惊奇地发现，GnRH I和GnRH II肽的抗增殖活性可通过取代肽序列中的特定氨基酸残基来进行调节。人类GnRH I的肽序列(使用氨基酸残基的三字符密码子进行显示)为PG1U-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly. NH20人类GnRH II的肽序列(使用氨基酸残基的三字符密码子进行显示)为pGlu_His -Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly. NH20特别地，本专利技术人发现，在GnRH I肽序列的位置5和/或7和/或8取代氨基酸残基(特别地在位置8除去精氨酸残基)可导致增强的抗增殖活性。而且，在GnRH II肽序列的位置6引入一定的D-氨基酸残基可导致增强的抗增殖活性。这个令人惊奇的发现提供了用于治疗抗增殖性失调(例如癌症)的有力的和选择性试剂。相应地，在第一个方面，本专利技术提供了用于药物的包含以下肽序列的试剂pGlu-His-Trp-Ser-Rl-Gly-R2-R3-Pro-A，其中a) Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Arg ;或b) Rl 是 Tyr，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或c) Rl 是 Tyr，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或d) Rl 是 His，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或e) Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或f) Rl 是 Tyr, R2 是 Trp 和 R3 是 Tyr ；且其中A选自Z ;或azaGly ;或azaGly. Z ;或DAla. Z ;或Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或β Ala. Z ;或Pro ;或Pro. ZDAla-Gly. Z ;或Gly. Z,其中Z是除去了 C末端氨基酸残基上电荷的基团。优选地，Z具有小于200的分子量，优选为小于150，优选为小于100。优选地，Z是 NHR’，其中R’是H或C1至C4烷基或者Z是0R”，其中R” C1至C4烷基。优选地，Z是酰胺。 优选地，Z是NH2或N-丙胺或N-乙胺(NHEt)或N-甲胺或N- 丁胺。缩写“pGlu”代表经修饰的氨基酸，焦谷氨酸盐(pyroglutamate )。优选地,A是azaGly. NH2。缩写“azaGly”代表氮杂甘氨酸(azaglycine),其中C-H 基团被氮原子所取代。缩写“azaGly. NH2”代表氮杂甘氨酸的酰胺化形式。优选地，A是 DAla. NH2 或 Glu. NH2。缩写 “DAla. NH2” 和 “Glu. NH2” 代表分别 D-丙氨酸残基和谷氨酸盐残基的酰胺化形式。优选地，A是 DAla-Glu. NH2 或 DAla-DAla. NH2 或 DAla-Gly. NH2。优选地，A是β Ala. NH2。缩写“ β Ala”代表β -丙氨酸，丙氨酸的一种经修饰的形式，其中氨基基团位于相对于羧基基团的β (贝塔)位置。缩写“i3Ala.NH2”代表β-丙氨酸的氨酰化形式。优选地，A是Pro. Z，其中Z选自NH2、N-丙胺、N-乙胺、N-甲胺或N- 丁胺。缩写“Gly. NH2”代表甘氨酸残基的酰胺化形式。优选地，本专利技术的试剂在其C末端含有不带电的C末端残基，这可通过用C末端基团例如NH2或NHEt (N-乙胺)进行修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含选自以下肽序列的试剂：w）pLGlu?LHis?LTrp?LSer?LHis?DArg?LTrp?LTyr?LPro.Y；x）pLGlu?LHis?LTrp?LSer?LHis?DArg?LTrp?LTyr?LPro?A；y）pLGlu?LHis?LTrp?LSer?LHis?DArg?LLeu?LArg?LPro?A；z）pLGlu?LHis?LTrp?LSer?LHis?DSer?LTrp?LTyr?LPro?A；其中，Y是NHEt或NH2或DAla.NH2或Z；且A选自：Z；或azaGly；或azaGly.Z；或DAla.Z；或Glu.Z；或DAla?Glu.Z；或DAla?DAla.Z；或βAla.Z；或Pro；或Pro.Z；或DAla?Gly.Z；或Gly.Z，其中Z是除去了C末端氨基酸残基上电荷的基团。

【技术特征摘要】
2006.08.12 GB 0616111.1;2006.06.16 US 60/805,042;1.一种包含选自以下肽序列的试剂w) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. Y ； x)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-A ； y) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LLeu-LArg-LPro-A ； z) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-A ； 其中，Y是NHEt或NH2或DAla. NH2或Z ;且A选自 Z ;或 azaGly ;或 azaGly. Z ;或 DAla. Z ;或 Glu. Z ;或 DAla-Glu. Z ;或 DAla-DAla. Z ;或 3 Ala. Z ;或 Pro ;或 Pro. Z ;或 DAla-Gly. Z ;或 Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸残基上电荷的基团。2.根据权利要求I所述的试剂，其中Z是NH2或NHEt。3.根据权利要求I或2所述的试剂，其中肽序列选自wl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. NHEt ；xl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH2 ；yl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LLeu-LArg-LPro-Gly. NH2 ；zl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH204.一种用于药物的包含肽序列pGlu-His-Trp-Ser-Rl-Gly-R2-R3-Pro_A的试剂，其中 a)Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Arg ;或 b)Rl 是 Tyr，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或 c)Rl 是 Tyr，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或 d)Rl 是 His，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或 e)Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或f)Rl 是 Tyr, R2 是 Trp 和 R3 是 Tyr ； 且其中A选自 Z ;或 azaGly ;或 azaGly. Z ;或 DAla. Z ;或 Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或.3 Ala. Z ;或Pro ;或Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸残基上电荷的基团。5.一种用于药物的包含妝序列 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr/His_Gly-Leu/Trp-R4-Pro-A的试剂，其中R4是除了精氨酸以外的任何氨基酸，且A选自Z ;或azaGly ;或azaGly. Z ;或DAla. Z ;或Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或3 Ala. Z ;或Pro ;或Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸残基上电荷的基团。6.根据权利要求5所述的试剂，其中R4选自丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、酪氨酸。7.根据权利要求4至6任一项所述的试剂，其中Z是NH2或NHEt。8.根据权利要求4至7任一项所述的试剂，其中肽序列选自 al) pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly. NH2 ；bl) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Arg-Pro-Gly. NH2 ；cl) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Tyr-Pro-Gly. NH2 ；dl) pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Arg-Pro-Gly. NH2 ；el) pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Tyr-Pro-Gly. NH2或f I) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly. NH209.一种包含以下肽序列的试剂在制备用于治疗增殖性失调的药物中的用途pLGlu-LHi s-LTrp-LSer-LHi s-X-LTrp-LTyr-LPro-A，其中 X 是 D-氨基酸残基，且 A 选自Z ;或azaGly ;或azaGly. Z ;或DAla. Z ;或Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或3Ala. Z ;或Pro ;或Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z， 其中Z是除去了 C末端氨基酸残基上电荷的基团。10.根据权利要求9所述的用途，其中X选自D-精氨酸、D-赖氨酸、D-色氨酸、D-赖氨酸、D-酪氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸。11.一种包含选自以下肽序列的试剂在制备用于治疗增殖性失调的药物中的用途i)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-A ；ii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LTrp-LTyr-LPro-A ；iii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LGln-LPro-A ；iv)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LLeu-LPro-A ；v)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LTyr-LPro-A ；v-B ) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LArg-LPro-A ；vi)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DTrp-LTrp-LArg-LPro-A ；vii)pLGlu-LHis-LTrp-LS...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·P·米勒，S·R·莫兹利，R·洛佩斯德马图拉纳加门迪亚，
申请(专利权)人：医疗研究局，
类型：发明
国别省市：