本发明专利技术公开了一种地加瑞克的人工合成方法，以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/HOBt为偶联剂进行接肽反应，4位丝氨酸以叔丁基二甲基代替叔丁基保护羟基，5位苯丙氨酸苯环4位氨基相连的氢化乳清酸片段先以三苯甲基保护，最后再引入，避免了重排副反应发生，以D-4Aph(Cbm)代替D-4Aph(Cbm-tBu)，避免了t-Bu脱除困难，减少了副反应发生。本发明专利技术的合成工艺步骤简单，易于控制，环境污染小，收率高，适于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有生理活性的多肽的合成方法，具体地说是地加瑞克的人工合成方法。
技术介绍
地加瑞克，英文通用名Degarelix，是一种促性腺激素释放激素(GnRH)受体抑制剂类药物，可逆性抑制垂体GnRH受体来减少促性腺激素释放继而抑制睾酮的释放，通过抑制对前列腺癌持续生长至关重要的睾酮而延缓前列腺癌的生长和恶化。是目前唯一临床用于晚期前列腺癌的GnRH受体拮抗剂。其氨基酸序列为，Ac-D-2Nal-D-4 Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph (L-Hor)_D_4Aph(Cbm)-Leu-Ilys· -Pro-D-Ala-NH2,结构式如下 γ,η. . I · MN 感 in: 地加瑞克从用药开始就能降低睾酮浓度，不会产生如GnRH激动剂(如戈舍瑞林、亮丙瑞林等)带来的“先升后降”现象。Degarelix降低睾酮浓度的效果与亮丙瑞林储库型控释注射剂相当，并且降低睾酮浓度在统计学上显著快，在治疗的整个I年中始终抑制前列腺特异抗原。地加瑞克能快速、持久的控制睾酮水平来抑制前列腺癌的发展，并且耐受性与目前上市药物相当。随着中国社会老龄化加快，前列腺癌的发病逐年提高，Degarelix的市场潜力巨大。地加瑞克为含有7个非天然氨基酸的线性十肽，其中含有5个氨基酸为D构型氨基酸。专利文献最初由Ferring公司Semple Graeme和Jiang Guangcheng合作研发，专利文献W09846634报道的地加瑞克固相合成方法，采用Boc策略，以N-Boc-D-Ala偶合于树脂上，然后以TFA脱除Boc保护基，然后按照氨基酸的次序进行接肽反应，脱保护。其中5位和6位的4-氨基苯丙氨酸(Aph)需要采用Fmoc保护基进行保护，然后再用哌啶/DMF溶液脱除，再与叔丁基异氰酸酯或L-氢化乳清酸反应，然后再顺次接连下一肽键。最后经醋酸酐酰化后，用 HF 脱除 4 位的 Ser-OBn，6 位的 Aph-Cbm-tBu 和 8 位的 Lys-NCbz。W09846634还提到了另外一种方法，只是5位氨基酸侧链上的乳清酸放在整个肽链完成之后再引入。专利文献US6214798B1公开一种地加瑞克的液相合成方法，提出的液相合成方式更适合大量制备产品。最终产品的纯度大约在98%，然而在已有文献指出(J. Med.Chem.，2005,48, 4851-4860)按照同样方式制备的产品通过毛细管区域凝胶电泳测量纯度为98%，HPLC测量仅为96%。并且最后使用HF等危险气体，不利于工业生产。专利文献W02010121835公开了一种采用Fmoc法来制备Degarelix的技术方案，由文献(J. Chem. Soc. Perkin, Trans. 2，1984, pgl077_1081; Org. BiomoI. Chem. , 2004,pgl098-1103)可知，5 位氨基酸侧链上的L-氢化乳清酸结构在碱性条件下不稳定，容易重排生成海因(Hydantoin)结构的副产物。并且通过实验发现在浓NaOH调节pH值处理时会生成4. 5%重量比的副产物，2%的DBU/DMF(1, 8- 二氮杂二环 i^一碳-7-烯/基)处理degarelix产生I. 8%海因结构产物，如果含5%的水，副产物则增加至7%。但是在20%的哌啶/DMF (二甲基亚砜)溶液中degarelix没有任何降解。最后采用该法可以制备小于O.3%重量百分比的相关物质的degarelix，并且减少了 L-氢化乳清酸的重排产物生成，另外避免了上述Boc法大量使用TFA，减少了环境危害，降低了对人体的高毒的TFA (三氟乙酸)的危害。专利文献W02011066386指出上述Fmoc策略中使用t_Bu保护丝氨酸的羟基，脱保护试验表明，一般条件并不能完全脱除t-Bu保护，需要100%的TFA (三氟乙酸)处理25小时才能完成脱保护，在这种强烈的反应条件下，副反应和副产物的增多，会影响了最终产品的质量，如果采用45°C反应可以完全脱除，但是仍会产生降解产物影响最终产品的质量。采用Trt保护丝氨酸的羟基，可以在95%TFA (三氟乙酸)，2. 5%TIS (三异丙基硅烷)，2. 5EDT(1，2-乙二硫醇)溶液中45°C下广2小时脱除。采用这一策略制备的Degarelix HPLC纯度达到98. 5%以上，采用酸容易解离的Trt保护，由于Trt基团的空间位租大和疏水性，造成肽键形成困难，需要较长的反应时间进而产生更多的副产物以及序列肽缺失和消旋。因此，急需一种工艺简单、易于控制质量且适于大工业生产的1，4，5，6_四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工化学合成工艺。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了地加瑞克的的人工合成方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的 一种地加瑞克的固相合成方法，包括以下步骤 以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/ HOBt为偶联剂进行接肽反应，依次连接Fmoc保护的氨基酸，获得保护的十肽树脂，期间依次脱去氨基酸上的Fmoc基团，获得保护的十肽树脂后，脱除氨基酸的侧链保护基，切肽获得地加瑞克粗品，然后纯化的地加瑞克，包括以下步骤 1)树脂溶胀和脱保护 将Fmoc保护的氨基树脂装入固相反应柱中，以DMF洗涤Γ4次，然后以DCM溶胀20 40分钟，抽滤去除DCM，加入20% DBLK溶液脱除氨基树脂的Fmoc保护基，然后以DMF洗涤4飞次； 2)制备Fmoc- D-Ala-树脂 冰浴下将Fmoc-D-Ala-OH和HOBt溶于DMF中，然后加入DIC活化5 10分钟，将活化好的溶液重复加入步骤I)所得的树脂中反应，至茚三酮检测法检测树脂呈阴性时停止反应，树脂以DMF洗涤4飞次，得Fmoc- D-Ala-树脂；3)制备Fmoc-D-Ala- Pro- ILys (Boc) - Leu- D~4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)-Ser(x)- D-3Pal- D-Phe (4C1) - D_2Nal_ 树脂: 将步骤2)所得的Fmoc- D-Ala-树脂用DMF洗涤2 6次，加入20% DBLK溶液脱除Fmoc保护基，以DMF洗涤4飞次，然后按照步骤2)的操作进行接肽反应，依次将 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys (Boc) -OH> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D_4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-L_4Aph (Trt)-OH、Fmoc-Ser (X)-OH、Fmoc -D-3Pal_0H, Fmoc -D-Phe (4C1) -OH, Fmoc-D-2Nal-0H按照地加瑞克的氨基酸序列进行连接； 4)制备Ac-D-Ala- Pro- ILys (Boc) - Leu- D~4Aph (Cbm) - L-4Aph (Trt) - Ser (x)-D-3Pal- D-Phe (4C1) - D_2Nal_ 树脂: 步骤3)反应完毕后将树脂以DMF洗涤2 6次，加入20% DBLK溶液脱除Fmoc保护基，然后加入乙酸酐和吡啶，用茚三酮检测法检测，反应完成后抽干，以DMF洗涤31次；5)制备Ac-Ala- Pro- ILys (Boc) - Le本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/?HOBt为偶联剂进行接肽反应，依次连接Fmoc保护的氨基酸，获得保护的十肽树脂，期间依次脱去氨基酸上的Fmoc基团，获得保护的十肽树脂后，脱除氨基酸的侧链保护基，切肽获得地加瑞克粗品，然后纯化的地加瑞克，包括以下步骤：1）?树脂溶胀和脱保护将Fmoc保护的氨基树脂装入固相反应柱中，以DMF洗涤1~4次，然后以DCM溶胀20~40分钟，抽滤去除DCM，加入20%?DBLK溶液脱除氨基树脂的Fmoc保护基，然后以DMF洗涤4~6次；2）制备Fmoc??D?Ala?树脂:冰浴下将Fmoc?D?Ala?OH和HOBt溶于DMF中，然后加入DIC活化5~10分钟，将活化好的溶液重复加入步骤1）所得的树脂中反应，至茚三酮检测法检测树脂呈阴性时停止反应，树脂以DMF洗涤4~6次，得Fmoc??D?Ala?树脂；3）制备?Fmoc?D?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph(Trt)??Ser(x)??D?3Pal??D?Phe（4Cl）??D?2Nal?树脂：将步骤2）所得的Fmoc??D?Ala?树脂用DMF洗涤2~6次，加入20%?DBLK溶液脱除Fmoc保护基，以DMF洗涤4~6次，然后按照步骤2）的操作进行接肽反应，依次将Fmoc?Pro?OH、Fmoc?ILys（Boc）?OH、Fmoc?Leu?OH、Fmoc?D?4Aph(Cbm)?OH、Fmoc?L?4Aph(Trt)?OH、Fmoc?Ser(x)?OH、Fmoc??D?3Pal?OH，Fmoc??D?Phe（4Cl）?OH，Fmoc??D?2Nal?OH按照地加瑞克的氨基酸序列进行连接；4）制备Ac?D?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph(Trt)??Ser(x)??D?3Pal??D?Phe（4Cl）??D?2Nal?树脂：步骤3）反应完毕后将树脂以DMF洗涤2~6次，加入20%?DBLK溶液脱除Fmoc保护基，然后加入乙酸酐和吡啶，用茚三酮检测法检测，反应完成后抽干，以DMF洗涤3~8次；5）制备Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph??Ser(x)??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?树脂:在装有Ac?D?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph(Trt)??Ser(x)??D?3Pal??D?Phe（4Cl）??D?2Nal?树脂的的固相反应柱中加入体积比为10％的TFA/DCM溶液，室温搅拌反应后，抽干，以DMF洗涤3~8次；6）制备Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph（Hor）??Ser(x)??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?树脂:将L?4,5?二氢乳清酸溶于DMF中，加入HOBt，再加入DIC活化，然后将活化好的溶液加入装有Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph??Ser(x)??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?树脂的的固相反应柱中，搅拌反应2小时后，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤3~8次；7）制备Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph（Hor）??Ser??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?树脂：在装有Ac?Ala??Pro??ILys（Boc）??Leu??D?4Aph(Cbm)??L?4Aph（Hor）??Ser(x)??D?3Pal??D?4?Cpa??D?2Nal?树脂的固相反应柱中，加入TBAF的DMF溶液,搅拌反应2小时后以DMF洗涤3~8次；8）裂解制备粗肽：将冰冻的裂解液加入到烘干的树脂中，搅拌反应2小时，将反应液加入乙醚中，冰冻20~60分钟，离心，以DMF洗涤6次，至pH为中性为止，分离，干燥后得粗肽；9）纯化得地加瑞克精肽：将步骤8）所得粗肽经分离纯化得地加瑞克精肽；所述氨基树脂选自Rink?amide?AM、?Rink?amide?MBHA中的一种；步骤2所述Fmoc?Ser(x)?OH?的保护基x选自TBDMS、OBn中的一种；步骤8）所述裂解液由TFA、TIS、苯酚、苯甲醚组成，TFA、TIS、苯酚、苯甲醚的体积比为95:?2:2:1。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：厉保秋，袁强，陈明鲁，房世红，董欣，李娜，
申请(专利权)人：济南环肽医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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