本文阐述结合有工业意义的小靶标分子的小肽结构域和共有序列，所述有工业意义的小靶标分子例如金属例如镍、β胡萝卜素和异黄酮例如染料木黄酮。同样阐述含有所述结合结构域的融合蛋白，所述结合结构域与蛋白质或与肽结构域例如GST或CBD融合，所述蛋白质或肽结构域结合其它配体，可用于将所述靶标结合结构域固定在支持体上。可用于工业环境的融合蛋白中的一类是含有靶标结合结构域串联体的融合体，所述融合体增加每分子的结合当量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合有工业意义的小分子的肽结构域相关申请的交叉引用 本申请要求于2010年I月29日提交的美国专利申请序列号61/299，449的申请日权益，其公开内容通过引用并入本文中。背景 一直在将能够结合特异性靶标分子的肽用于生物学、医学、制药领域的各类研究和产品开发工作中。在这些领域中，靶标分子通常是具有生物学意义的分子，例如病变细胞或致病细胞的肽表位、表面受体蛋白、信号转导蛋白、在生物学应答例如免疫T细胞和B细胞应答的病因学中涉及的蛋白质和用于生物学研究的靶标，例如与核酸结合的蛋白质或为鉴定和筛选目的需要特异性结合配体的生物学感兴趣的其它蛋白质。为获得具有特定靶标结合活性的肽而最长期使用的工具来自对免疫反应的开发，·最初是通过获得多克隆抗体，例如通过注射靶标分子攻击动物以获得B细胞应答来诱导IgG和IgM，并从血液中分离抗体。随后，从杂交瘤细胞克隆中获得单克隆抗体，所述杂交瘤细胞克隆产生结合靶标分子的特定表位的单一种类的抗体。有用的抗体具有以通常为10_7M或更小、更通常为10_8 M-10_9M的摩尔解离常数(Kd)结合靶标分子的能力。这些技术完全依靠开发天然生物免疫系统，所述系统能够重组抗体高可变结构域的编码序列以产生极为多样化的抗体，并具有天然刺激与目的靶标分子结合的少量抗体增殖的能力。就单克隆抗体而言，天然诱导的增殖被人为的选择和培养表达特异性抗体的克隆的能力所取代。尽管已经证明使用抗体成为用于获得结合特定靶标分子的肽的强大工具，但抗体的工业应用的效用受到限制。首先，抗体必须由全血、鸡蛋或杂交瘤组织培养物制备，与结合靶标分子的工业规模需求相比，所有这些都是昂贵而低产量的生产系统。其次，它们依赖在抗体分子高可变区形成的结合结构域的三维结构，这需要生产相当大的蛋白质(即使是单链可变片段情况下)，以获得结合每一摩尔靶标分子所需的相对较小的肽结构域的I摩尔结合当量。最近，用于鉴定靶标结合结构域的抗体的较新的备选品是开发细菌蛋白展示系统，最值得注意的是噬菌体展示系统。这些系统以与表面蛋白的融合蛋白的形式来展示肽或整个蛋白的序列，例如对于噬菌体展示，将肽表达为与噬菌体颗粒蛋白的融合蛋白。噬菌体展示是用于探索组合随机肽文库的序列空间的最强大和完善的技术之一。通常外源蛋白/肽作为与次要外壳蛋白PlII或主要外壳蛋白PVIII的融合蛋白表达于M13噬菌体表面上。可针对靶标分子(固定在珠粒上或吸附于微量滴定板孔中)筛选具IO7-IO11多样性肽(具有5-40个残基)的文库，经过结合和感染的反复轮次富集特定的结合物。通过ELISA检测富集池中单个克隆的结合，通过测定噬菌体颗粒中的DNA序列来解码结合肽的氨基酸序列。然后可将肽配体的氨基酸序列与蛋白质数据库比较，以计算机鉴定潜在的内源互作蛋白。噬菌体展示技术主要用于鉴定蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽和蛋白质-DNA的相互作用，因此，尤其用作鉴定靶标肽的研究工具，所述靶标肽与生理学重要的蛋白例如抗体和受体相互作用，或与特定DNA序列结合，或与潜在候选药物结合以便发现用于药物应用的潜在生理学靶标蛋白。然而，很少将噬菌体展示用于鉴定与有工业意义的小分子结合的肽，所述有工业意义的小分子例如在工业生产液流中的污染物或金属离子。尽管作为研究工具有用，但一直未显示噬菌体展示作为实际生产用于在任何工业加工或产品方面的商业部署的肽结构域的工具的实用性。然而，业已阐述少数金属结合肽。在金属结合肽中发现的一种金属结合基序为6个组氨酸(“多组氨酸”)的序列，已知其能够结合镍。可获得含有其中启动子与编码含多组氨酸的肽的区域连接的核酸序列的表达载体，以制备所谓的“组氨酸-标签”融合蛋白，所述融合蛋白可通过依靠多组氨酸结构域结合固定在柱上的镍的能力自细胞提取物中快速分离。用过量咪唑从柱中洗脱结合的蛋白。如果克隆载体在融合蛋白框架内另外编码蛋白酶底物位点，则可用蛋白酶将多组氨酸结合结构域自洗脱蛋白裂解。最为人知晓的多组氨酸结合结构域是包含6个组氨酸核心序列的肽，如以序列YSHHHHHHLAGTA (SEQ ID NO 1)为例所示，其对镍的摩尔解离常数为2. 3 χ 1(Γη Μ。另外一种已知多组氨酸结合结构域为组氨酸-谷氨酰胺二肽的6聚体重复的12个氨基酸的肽，即(HQ)6 (SEQ ID NO :2)，精氨酸也表明是在镍结合中起重要作用的氨基酸残基，因为亦显 示共有序列RHXHHR (SEQ ID NO 3)(其中X最常为组氨酸)以高亲和力结合镍(Jie等，Chemical Biology & Drug Design (2006) 68 .-107-112) 0 Jie 等人通过筛选形成经工程改造以在鞭毛上展示蛋白的细菌文库的肽鉴定了该序列，并提示展示所述序列的细菌可能用作生物衍生的废水修复剂(remediation agent)。Behnaz 等人(Zra/ ia/ /otfraaJ of Biotechnology (2005) J ..7洲-765)用相似的系统揭示结合金属的肽的极为不同的基序，其显示经由纤毛(fibrinea)融合蛋白展示于大肠杆菌(疋co7i)表面上的富半胱氨酸肽GCGCPCGCG (SEQ ID NO :4)，能够以相对次序铅〉镉〉镍结合金属。关于半胱氨酸，显示通过与OmpX膜蛋白融合在其表面展示含半胱氨酸肽LCCYWSYSRMCKN(SEQ ID NO :5)(选自随机产生的11-聚体文库，11-聚体中，2个半胱氨酸被7个氨基酸分开且每一个侧翼有2个氨基酸)的大肠杆菌，与悬浮液中的金颗粒结 (Kaviani, Biological Applications NNIN REU (2006) Research Accomplishments,第12-13页)。通过噬菌体展示用M13鉴定了序列LKAHLPPSRLPS (SEQ ID NO 6)的含脯氨酸/羟基金结合肽(Nam等，Science (2006)312:885-888)。同样地但在不相关的工作中显示，通过噬菌体表面展示鉴定的几个富含羟基但没有特定共有序列的肽结合铝，其中肽VPSSGPQDTRTT(SEQ ID NO 7)显示特别强的结合(Zao 等，Appl. Microb. and Biotech.(2005) CU防-见功。业已提议金结合肽可能用于微电子纳米结构的组装。其他人证明在M13噬菌体文库上展示的金属结合肽可用作改进催化活性的生物模板催化剂(Nelner等，ACS Nano (2010) 4 :3227-3235、。尽管有这些建议，但是单独的噬菌体展示或其它细菌展示系统还不适于在实际工业规模处理中部署，所述实际工业规模处理例如水修复、回收贵重金属或从工业生产液流中去除污染物。这是因为结合工业规模工业生产液流中的靶标分子所需的结合位点的量非常大。举例而言，经由细菌细胞培养物产生的典型噬菌体滴度大约为IO12颗粒/mL。即使假定每个颗粒展示IO3个结合蛋白，每个蛋白结合一当量靶标分子，这需要6. 02 χ IO8 mL或602，000升细胞培养物以产生足够多的颗粒仅仅结合I摩尔靶标分子。I摩尔镍是60g的材料，典型的水密集型工业生产加工例如在湿磨设备中每天加工250，000蒲式耳本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：TP宾德，AG劳，山本康文，P汉克，
申请(专利权)人：阿切尔丹尼尔斯密德兰公司，衣阿华州立大学研究基金公司，
类型：
国别省市：
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