结构化肽加工制造技术

本发明专利技术涉及用于修饰一种或多种肽配体的方法，所述肽配体包含在两个或更多个氨基酸残基上与分子支架共价连接的多肽，所述方法包括以下步骤：提供一种或多种肽配体，其中所述多肽包含与所述分子支架形成共价键的两个或更多个活性基团，和至少一个环，其包含位于两个所述活性基团之间的两个或更多个氨基酸的序列；将所述肽配体暴露于一种或多种蛋白酶；和根据蛋白水解切割的程度分选所述配体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结构化肽加工本专利技术涉及肽的加工，所述肽的结构因与化合物结合而受约束，所述化合物提供结构骨架，赋予所述肽构象。具体而言，本专利技术涉及这类肽的蛋白水解处理，以选择蛋白酶抗性肽或者选择所产生的切割产物。介绍对生物靶标有高亲和力和特异性的分子的制备是化学、生物和制药科学的中心问题。具体而言，结合配体对于可干预生物过程的药物的制备是重要的。与所选靶配体结合的配体的制备通常包括产生众多推定的结合分子和检测所述分子的结合性能的过程。合成的分子结构所束缚的多肽在本领域中已知(Kemp，D. S.和McNamara, P. E.， J. Org. Chem, 1985 ；Timmerman, P.等人，ChemBioChem，2005)。Meloen 和同事们曾使用三 (溴甲基)苯和相关分子进行将多个肽环快速和定量环化至合成支架上，以用于蛋白质表面的结构模拟(Timmerman，P.等人，ChemBioChem，2005)。制备候选药物化合物的方法在 WO 2004/077062和WO 2006/078161中公开，其中通过将含半胱氨酸的多肽连接到分子支架(如例如三(溴甲基)苯)来制备所述化合物。W02004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。具体而言，此文件公开了包含第一和第二活性基团的各种支架分子，并在偶联反应中用另一种分子接触所述支架以在所述支架和所述另一种分子之间形成至少两个键。W02006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和肽模拟物。此文件公开了从现有的蛋白质中获得的肽的各个集合的人工合成。然后将这些肽与具有为了制备组合文库而引入的一些氨基酸变化的固定合成肽结合。通过经由化学键引入此多样性来分离以各种氨基酸变化为特征的肽，使获得所需结合活性的机会增加。此文件的图7显示各种环肽构建体的合成示意图。然而，所产生的肽有单特异性。在提供多个肽环的位置，所述环协同结合到单一靶标。在我们共同待审的国际专利申请W02009098450中，我们公开了将生物选择技术例如噬菌体展示用于选择合成的分子结构所束缚的肽。在本领域中已知修饰多肽(包括多肽库)的蛋白水解处理的应用。例如， GB2428293 (Domantis Limited)描述了以下方法，其通过用蛋白酶处理噬菌体来还原噬菌体上所展示肽的化合价，使得大多数噬菌体不展示肽和一部分是单价的。基于噬菌体展示蛋白对蛋白水解降解的抗性而从该蛋白库中选择稳定折叠的蛋白质的策略，已用于改善天然蛋白质的稳定性。蛋白水解的降解通常限制于解折叠的蛋白质或折叠蛋白质的高度柔性区域。折叠的蛋白质大部分是蛋白酶抗性的，因为蛋白水解切割要求多肽链呈蛋白酶活性位点的特定立体化学，从而使蛋白酶活性位点有柔性、可接近和能够局部解折叠。此外，本领域中已将蛋白酶用于制备所需切割产物，例如在Fc、Fab和Fv抗体片段的制备中。我们发现，蛋白酶消化技术可适于修饰合成分子支架所束缚的结构化多肽，无论其是否在噬菌体上展示。这些技术不仅使蛋白酶抗性结构化肽的制备而且使蛋白酶切割产物的制备成为可能，在上述蛋白酶切割产物中大多数多肽仍然束缚于支架。专利技术概述在第一个实施方案中，提供制备一种或多种肽配体的方法，所述肽配体包含在两个或更多个氨基酸残基上与分子支架共价连接的多肽，所述方法包括以下步骤(a)在遗传展示系统中展示一种或多种肽配体，其中所述多肽包含两个或更多个与分子支架形成共价键的活性基团和至少一个环，所述环包含位于(subtend)两个所述活性基团之间的两个或更多个氨基酸的序列；(b)将所述肽配体暴露于一种或多种蛋白酶；和(c)针对靶标结合筛选所述肽配体，和选择与所述靶标结合的配体。在相关的实施方案中，本专利技术提供制备一种或多种肽配体的方法，所述肽配体包含在两个或更多个氨基酸残基上与分子支架共价连接的多肽，所述方法包括以下步骤(a)在遗传展示系统中展示一种或多种肽配体，其中所述多肽包含两个或更多个与分子支架形成共价键的活性基团和至少一个环，所述环包含位于两个所述活性基团之间的两个或更多个氨基酸的序列；(b)针对靶标结合筛选所述肽配体，和选择与所述靶标结合的配体；(c)将与所述靶标结合的肽配体暴露于一种或多种蛋白酶；和(d)针对靶标结合进一步筛选所述肽配体。可应用的系统包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体或多核糖体展示、 mRNA展示和人造微荚膜中的体外表达。在Litovchick等人，PNAS 10月7日，2008年第105 卷第40期；15293-15298中描述了 mRNA展示系统。优选技术是使用丝状噬菌体的噬菌体展不。针对与一个或多个靶标结合的能力选择肽配体。所述配体可为单特异性的，即它们与单一靶标结合；或多特异性的，即能够与两个或更多个不同靶标结合。多特异性配体可呈开放构象，其中它们可同时与两个或更多个不同的靶标结合；或可呈闭合构象，其中它们在任何时候只可与一个靶标结合。肽配体包含至少一个多肽环，所述多肽环由位于至少两个与分子支架连接的活性基团之间的氨基酸序列形成。优选的是，所述肽配体包含两个或更多个环，可包含3个、4个或更多个环。例如，所述多肽可包含3个或更多个活性基团，两个或更多个环位于所述活性基团之间。包含3个活性基团的多肽在线性形式下将支持两个环，或如果被环化则支持三个环。本专利技术方法的具体应用是要制备肽配体的库。这类库可例如通过在噬菌体上展示多肽的库和随后将它们与分子支架缀合来制备，如W02009098450所述。可将蛋白水解用来在配体上原位修饰肽，或者选择抵抗蛋白水解攻击的那些缀合物。因此，在第一个结构中，本专利技术涉及对有蛋白酶抗性的肽配体的选择。这类配体可用于存在蛋白酶的环境中，例如在粘膜表面。在此结构中，本专利技术尤其可用于缀合物的库，所述库可根据它们的蛋白酶抗性来筛选及分类。所述库可在蛋白水解处理时首次用于实验(naive)，而选自所述库的有蛋白水解抗性的成员可在蛋白水解处理后针对与一个或多个靶标的结合进行筛选。在这样的一个实施方案中，所述方法优选地还包括任选使用还原剂处理所述库；对所述库进行蛋白酶抗性选择；针对靶标结合筛选所述库，和选择与所述靶标结合的第一个库的成员。在另一个实施方案中，在蛋白水解处理前可针对与一个或多个靶标的结合筛选所述库。在这样的一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤针对靶标结合筛选所述库， 和选择在蛋白酶处理前与所述靶标结合的第一个库的成员；任选使用还原剂处理所选择的库；对所述库进行蛋白酶抗性选择；和随后针对与所述靶标的结合进一步筛选所述库。此外本专利技术涉及多肽的库，每个多肽包含两个或更多个与分子支架共价连接的活性基团，和至少一个环，所述环包含位于两个所述活性基团之间的两个或更多个氨基酸的序列，所述库为蛋白酶抗性的。如上文所述，这样的库可为首次用于实验的，或可针对与一个或多个靶标的结合进行选择。针对靶标结合的选择可在对蛋白酶抗性的选择之前进行，在对蛋白酶抗性的选择之后进行，或两者均进行。按照本专利技术的第二个结构，可用蛋白水解处理肽配体以产生固定在支架上的经切割的多肽。在这样的一个实施方案中，所述方法还包括选择对蛋白酶切割敏感的肽配体。例如，所述过程可产生包含两个或更多个独立多肽的配体，每一个所述多肽均在至少一个位置上与分子支架连接。这可使所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·G·温特，C·黑尼斯，E·贝纳，D·罗亚克斯，M·维斯伯德，
申请(专利权)人：医疗研究局，
类型：发明
国别省市：