血管紧张素II受体的选择性配体制造技术

在过去的十年出现大量A-GPCR(G蛋白偶联受体)种类的结构信息。然而配体对密切相关的受体亚型如血管紧张素受体AT1aR和AT2R的选择性的结构和电子基础知之甚少，所述受体亚型对相同配体的反应呈现完全不同的生物学功能。为了监测生物系统内的复合物反应，在选择性方面呈现梯度的配体是有用的。在本研究中，提出一种有效的方法来调整配体对两种血管紧张素II受体亚型(AT1aR和AT2R)的选择性，该方法通过芳香电子交换，控制血管紧张素II中芳香-脯氨酰基的相互作用。在这个策略的基础上，获得了对AT2R具有选择性和高亲和力的激动剂类似物(Ki＝3nM)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血管紧张素11受体的选择性配体
技术介绍
GPCR是细胞外环境向细胞内空间信号传导的关键因素1A尽管他们能够被从小的神经递质到激素的一系列细胞外配体激活,类视紫红质(rhodopsin-1 ike) GPCR3的关键结构元件的序列保守性提出一个共同的激活机制。最近GPCR的X射线结构…确定了 GPCR家族A整体的结构，并准确地指出配体结合口袋的结构。然而，这些结构也引出关于配体对密切相关的受体亚型的选择性机制的问题1A例如，尽管直接围在人肾上腺素受体bl和b2配体结合口袋周围的残基似乎相同，但是配体与两个受体亚型结合的特异性完全不同1’8。因此，在GPCR分子中识别不是一个仅依赖受体分子结构的简单过程，而是与配体结构密切相关。这在视紫红质激活机制中是很显而易见的，其中所述到其信号传导状态的转换是由其固有配体视黄醛的顺式到反式异构结构的转换来完成9“°。这种顺式/反式转换的主要结果是打破和/或减弱跨膜螺旋间的大部分静电约束，从而触发受体激活 ' 这种顺式向反式异构化转 换作为大多数生物过程的关键部分出现，以脯氨酸作为关键元素n_14。生物活性激素血管紧张素II (AU:DRVYIHPF)在其一级结构中有一个脯氨酸残基，其异构态在激活它的ATla和AT2受体亚型中可能很重要。在水性溶液中天然的AII普遍的构象是反式的(>95% )15。有趣的是，AII中的Pro7Gly突变提供构象的可塑性，几乎保留其与AT2R的亲和力，但是与ATlaR的亲和力呈现出150倍降低16。出现的一个关键问题是正式/反式相互转换的能量壁垒的降低是否将允许AII同时占有两种不同的构象(顺式和反式)，从而影响与AII两种受体亚型结合的亲和力与特异性。推定的脯氨酸异构化在受体亚型选择性中的作用可能最有价值，因为AT2R的激活作用(血管舒张、凋亡和抗增殖)与ATlaR介导的作用(对ATl的细胞生长和增殖)相反17_19。另外，因AT2R的激活抑制胰腺癌细胞的生长，这个受体是化学治疗这类癌症潜在的靶点2°’21。因此，通过联合使用调节性配体微调ATla和AT2受体的不同功能反应可作为强大的治疗工具22。这里，我们描述了通过芳香-脯氨酰基相互作用的电子控制微调配体对ATlaR和AT2R亚型选择性的一种新策略。基于这一策略建立了一个新的低亲和力nM且对AT2R有选择性的激动剂。
技术实现思路
本专利技术一方面，提供制备血管紧张素II受体选择性配体的方法，其包含以下步骤:(i)选择易于顺-反异构化的受体配体的基序；(ii)比较配体与含有所述基序的数据库中的序列并确定该基序内或附近的取代对顺式或反式异构体的形成的影响；(iii)根据步骤(ii)中的比较产生配体中的取代，从而利于配体中顺式或反式异构体。虽然密切相关的G蛋白偶联受体亚型的选择性配体的开发对解码受体病理生理学反应是重要的，但是其是冗长耗时的过程。在缺少对配体结合与亚型选择性间相互作用决定因素的理解时，反复试验和错误和意外发现的运气在选择性配体成功开发中发挥主要的作用。当受体亚型呈现相反的功能时，掌握实现选择性配体识别的原理是尤其重要的。这对两种AII受体亚型是明显的证据:很多病理学已经涉及到ATlaR，如心力衰竭、动脉粥样硬化、视网膜病变、心肌肥厚、血管平滑肌增生、和高血压等疾病37。相反，相较于AT1R，AT2R介导的功能相当不同，如抗增殖、抗炎症、神经分化、血管重构和肿瘤抑制2°’21’38_4°。因此AT2R已经被认为是重要的药学药物靶点。由于缺少具体的配体-受体识别相互作用的知识，针对AT2R的选择性配体的鉴定出现在长期细致的努力之后41。使用被激素AII以相似的亲和力识别的配体，我们已经开发出一种调节针对两种受体亚型的配体-受体选择性的策略。为了多肽能呈现顺-反异构化，需要一个N-取代的氨基酸。实施例包含肌氨酸和脯氨酸。优选，根据权利要求1的方法，基序包含脯氨酸。序列Pro-X，其中X是任何氨基酸，使顺式和反式的两异构体多肽具有相似的能量；这意味着两种异构体是理论上可能的。X的性质影响顺式和反式异构体间平衡。在一个优选的实施方案中，提供了一种根据本专利技术的方法，其中基序是X1-Pro-X2,其中X1和X2相同或不同，并可以为任何氨基酸。X1也对顺式和反式异构体间的平衡有影响。通过在这些位置的每个位点选择合适的氨基酸，能够定制偏向于一种或另一种异构体形式的配体，或在有些实例中能够具有两种异构体形式。在本专利技术的一个实施例中，X2是Phe。因此，可分析包含基序X-Pro-Phe的配体的偏向于顺式或反式异构体形式的能力；可以在一个数据库中评价顺式或反式异构体的发生率，如pdb，并将形成这种异构体的可能性配制给基于X-Pro-Phe基序中X的同一性的测试配体。通过这种方法，设计对AT2R或ATlR有选择性的配体。例如一个针对AT2R有选择性的配体在溶液中能够表现出顺式异构化增强。用于本专利技术方法中的、以及因此作为潜在配体基础的基序的来源是各种形式的血管紧张素。例如，配体可以是血管紧张素1、Π、ΙΙΙ、或IV的突变体或沙拉新。沙拉新是血管紧张素II的衍生物，其氮端和碳端的氨基酸分别被肌氨酸和丙氨酸取代。在一个实施方案中，基序是血管紧张素II(AII)中的His6-Pro7-Phe8基序。在一个实施方案中，His6残基被Tyr所替代，产生Tyr-Pro-Phe基序，和AII的Tyr6类似物。因此，在第二方面，本专利技术提供了针对血管紧张素II受体的配体，其具序列Asp-Arg-Val_Tyr_IIe-Tyr-Pro-Phe ο在一个替代的实施方案中，在AII的位置6中使用了 4-取代的Phe残基，其中引入了供电子或吸电子基团。因此，本专利技术提供了针对血管紧张素II受体的配体，其具有序列Asp-Arg-Val-Tyr-1le-Phe-Pro-Phe,其中Phe6在位置4上取代，即取代苯丙氨酸环对位的氢。一个实施方案中，配体对AT2受体是有选择性的。在一个替代实施方案中，配体对ATl受体具有选择性。一般而言，位置6的供电子取代偏向于对AT2R的选择性，吸电子取代偏向于对ATlR的选择性。AII受体亚型的配体选择性可以通过调节All (4-x-Phe6)位置6上引入的苯丙氨酸对位氢的简单取代的电子特征来准确描述。尤其是，具有供电子基团(-0H)的[Yu-All类似物产生一个对AT2R有选择性和高亲和力的结合物(Ki = 3.4±0.8nM)，然而，吸电子基团完全取消了对这个受体的高结合亲和力和选择性(图5)。最重要的是，这个受体识别表型直接与顺式特征的结构和由该电子控制诱导的4-X-Phe6-Pix)7-Phe8基序的紧密度相关。在位置6包含缺电子芳香残基的AII类似物相对不偏向于顺式酰胺键，并相对于富含电子的芳香残基呈现对AT2受体的选择性和亲和力下降。例如，相较于[Y]6-AII，[4-N02-F]6-AII呈现对AT2R亲和力300倍的降低，但是对ATlaR具有高亲和力(nM)(未发表数据)。同时，[F]6-AII对ATlaR和AT2R呈现相同的亲和力，但是相较于[Y]6-AII对AT2R的亲和力降低了 50倍以上(数据未发表)。这个顺式-反式异构化控制以调节Pro7和4-X-Phe6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备血管紧张素II受体选择性配体的方法，其包括步骤：(i)选择受体的配体基序，其对顺式‑反式异构化敏感；(ii)比较配体与含有所述基序的数据库的序列，并确定该基序中或附近的取代对顺式或反式异构体形成的影响；(iii)根据步骤(ii)中的比较产生配体的取代，从而在配体中偏向于顺式或反式异构体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.23 GB 1122261.9;2012.03.27 GB 1205397.11.一种制备血管紧张素II受体选择性配体的方法，其包括步骤: (i)选择受体的配体基序，其对顺式-反式异构化敏感； (?)比较配体与含有所述基序的数据库的序列，并确定该基序中或附近的取代对顺式或反式异构体形成的影响； (iii)根据步骤(ii)中的比较产生配体的取代，从而在配体中偏向于顺式或反式异构体。2.根据权利要求1的方法，其中基序包含脯氨酸。3.根据权利要求2的方法，其中基序是X1-Pro-X2，其中X1和X2是相同或不同并可以是任何氨基酸。4.根据权利要求3的方法，其中X2是Phe。5.根据上述任意权利要求的方法，其中配体对AT2R是选择性的。6.根据上述任意权利要求的方法，其中配体对ATlR是选择性的。7.根据权利要求5的方法，其中配体对AT2R是选择性的，并在溶液中呈现增加的顺式异构化。8.根据上述任意权利 要求的方法，其中配体是血管紧张素1、I1、III或IV的突变体或沙拉新。9.根据权利要求5所述的方法，其中基序是His6-P17-Phe81510.根据权利要求9所述的方法，其中His6残基被Tyr替换，产生Tyr-P1-Phe基序和AII的Tyr6类似物。11.根据权利要求9所述的方法，其中4-取代的Phe残基中引入供电子或吸电子基团取代苯丙氨酸环对位的氢。12.—种血管紧张素I...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·塔克斯，F·马尼亚尼，
申请(专利权)人：医疗研究局，
类型：发明
国别省市：英国;GB