用于检测样品中细菌ATP的包含ATP‑二磷酸水解酶的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测样品中细菌ATP的试剂盒。该试剂盒包含具有约6.0至7.2的pH的水性组合物。该水性组合物包含有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP‑二磷酸水解酶。还提供了一种使用该试剂盒检测细菌ATP的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测样品中细菌ATP的包含ATP-二磷酸水解酶的试剂盒相关申请的交叉引用本申请要求2014年11月13日提交的美国临时专利申请62/079,156的优先权，该专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。
技术介绍
需要对涉及工业过程的多种工业产品和其它样品(原材料、过程中样品、环境样品等)进行微生物污染测试。在一些情况下，最终产品必须是无菌的；在其它情况下，对所允许的微生物总数设定限制。经常对某些特定生物体的存在进行测试，并且此外可能对具体量的样品不存在要求或对所允许的数量可能有所限制。传统上，这些测试涉及使用培养技术。然而，这些传统的测试方法很慢。通常，在健康的、快速生长的细菌或酵母形成足够大的菌落以在琼脂板上轻松计数之前，一般需要花费至少24小时。然而，许多样品含有在其开始繁殖之前需要恢复期的应激微生物或在常见类型的培养基上生长缓慢的生物体(包括霉菌)。因此，许多经过验证的培养方法需要24-48小时的孵育期，并且在一些情况下需要5天或更多。现在许多微生物测试使用ATP生物发光反应检测从细胞(例如微生物细胞)中释放的ATP来更快速地进行。ATP是能量代谢的必要部分，并且因此是活生物体或其它有机物质存在的指示物。这些测试利用荧光素酶。生物发光试剂含有荧光素酶以及尤其是荧光素酶的底物荧光素、镁离子和合适的缓冲剂。当向此试剂中添加腺苷-5'-三磷酸(ATP)时，荧光素酶催化光发射。测试结果记录为RLU(相对光单位)值。RLU值通常与存在于测试样品中的微生物量成比例。某些样品(例如牛奶)可能含有相对高水平的与酪蛋白胶束相关的游离ATP和存在于体细胞中的ATP。在这些情况下，螯合剂可以用于破坏胶束，温和洗涤剂可以用于裂解体细胞，并且“非微生物”ATP可以使用三磷酸腺苷双磷酸酶(ATP水解酶)水解；从而能够实现对微生物ATP的检测。仍然需要简单、方便的检测微生物ATP的测试。
技术实现思路
本公开涉及包含在环境温度(例如约25℃)下格外稳定的ATP-二磷酸水解酶的水性组合物的试剂盒以及制备所述组合物的方法。已知包含ATP-二磷酸水解酶的基本干燥的组合物在0℃下是稳定的。还已知，当冷冻储存时，≥1mg/mL的ATP-二磷酸水解酶在水性组合物(pH5-7)中可以是稳定的。甚至还已知<1mg/mL的ATP-二磷酸水解酶可以储存在包含1mMMgCl2、1mmDTT、1mMEDTA和1mg/mL牛白蛋白的水性组合物(pH7.5)中。然而，还已知反复冻融循环和室温暴露数小时导致水性溶液中ATP-二磷酸水解酶活性的丧失。该组合物可以用于检测样品中细菌ATP的试剂盒中。本公开的专利技术性的水性组合物在室温(例如约21-25℃)下储存至少28天之后令人惊奇地保留了大于或等于约90％的初始ATP-二磷酸水解酶活性。有利的是，在环境温度下水性溶液中ATP-二磷酸水解酶的这种稳定允许在用于检测ATP生物发光的试剂盒中使用水性组合物。在一个方面，本公开提供了包含具有约6.0至7.2的pH的水性组合物的试剂盒。水性组合物可以包含有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP-二磷酸水解酶。在任何实施方案中，多元醇可以包括山梨醇，缓冲试剂可以包括HEPES、Tris和琥珀酸盐的混合物，并且蛋白质可以包括牛血清白蛋白。在另一个方面，本公开提供了在大于0℃储存至少7天的水性组合物中保留大于或等于90％的初始ATP-二磷酸水解酶活性的方法。该方法可以包括形成具有约6.0至7.2的pH的水性组合物，该组合物包含有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP-二磷酸水解酶；以及将该水性组合物于包括端值在内的1-25℃之间的温度下储存至少7天的时间段。水性组合物在第一时间点具有ATP-二磷酸水解酶活性的初始浓度。有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP-二磷酸水解酶的组合使得组合物保持在25℃下从第一时间点直到第一时间点后7天的第二时间点之后能够保留大于或等于90％的初始ATP-二磷酸水解酶活性。ATP-二磷酸水解酶活性是在pH7.75并使用非限速浓度的ATP、荧光素和荧光素酶的条件下用生物发光偶联测定法测量的。在上述方法的任何实施方案中，有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP-二磷酸水解酶的组合，可以使得组合物保持在25℃下从第一时间点直到第一时间点后28天的第二时间点之后能够保留大于或等于90％的初始ATP-二磷酸水解酶活性。在该方法的任一上述实施方案中，有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP-二磷酸水解酶的组合，可以使得组合物保持在25℃下从第一时间点直到第二时间点之后能够保留大于或等于95％的初始ATP-二磷酸水解酶活性。术语“包括”及其变型形式在说明书和权利要求书中出现这些术语的地方不具有限制的含义。如本文所用，“一个”、“一种”、“所述(该)”、“至少一个(种)”以及“一个(种)或多个(种)”可互换使用。因此，例如，一种缓冲试剂可以理解为“一种或多种”缓冲试剂。术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或者所列要素的任何两个或更多个的组合。另外，在本文中，通过端点表述的数值范围包括该范围内所含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。本专利技术的上述
技术实现思路
并非旨在描述本专利技术的每个公开的实施方案或每种实现方式。以下描述更具体地例示了示例性实施方案。在本申请全文的若干处，通过实施例列表提供了指导，这些实施例可以各种组合使用。在每种情况下，所引用的列表都只用作代表性的组，并且不应理解为排它性列表。在以下所示附图和说明书中阐述了这些和其它实施方案的另外细节。通过说明书和权利要求书，其它特征、目的和优点将变得显而易见。具体实施方式在详细阐释本公开的任何实施方案之前，应当理解，本专利技术在其应用中不限于以下说明中阐述或以下附图中示出的构造细节和部件布置方式。本专利技术能够拥有其它实施方案，并且能够通过各种方式实践或进行。另外，应当理解，本文使用的措词和术语是出于描述目的而不应被视为限制性的。本文使用的“包括”、“包含”或“具有”及其变型形式意在涵盖其后列出的项目及其等同形式以及附加的项目。现在已知本公开的水性组合物可以与荧光素酶、荧光素和ATP来源组合来检测样品中活微生物。水性组合物可以用于在微生物细胞(如果样品中存在的话)破坏之前从样品中去除“游离”ATP并且在生物发光酶促反应中检测与破坏的细胞相关的ATP。令人惊奇的是，组合物可以在环境温度或低于环境温度下储存至少四周的时间段后保留至少90％的初始三磷酸腺苷双磷酸酶活性。本公开提供一种试剂盒。在任何实施方案中，试剂盒可以用于检测与有活力的微生物相关的ATP。试剂盒包括本文公开的组分，以及任选地用于使用这些组分的说明书。试剂盒包含具有约6.0至约7.2的pH的水性组合物，该组合物包含有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP-二磷酸水解酶。本公开的水性组合物可以用于检测样品(例如，牛奶)中微生物ATP的方法。将水性组合物与可能包含非微生物ATP的样品混合(例如，稀释)。因此，通过ATP-二磷酸水解酶的作用从样品中消除无细胞(非微生物)ATP。随后，微生物(如果样品中存在的话)被裂解，并且可以使用本领域已知的检测方法(例如，ATP依赖性生物发光)检测微生物ATP。因此，本公开的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种试剂盒，其包含：具有约6.0至约7.2的pH的水性组合物，所述组合物包含有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP‑二磷酸水解酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.13 US 62/079,1561.一种试剂盒，其包含：具有约6.0至约7.2的pH的水性组合物，所述组合物包含有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP-二磷酸水解酶。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包含体细胞提取剂。3.根据权利要求1或权利要求2所述的试剂盒，其条件是所述组合物不包含有效量的杀微生物化合物。4.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其条件是所述组合物不包含有效量的二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇或β-巯基乙醇。5.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包含荧光素酶活性物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述荧光素酶活性物与所述水性组合物隔离。7.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述水性组合物的pH为约6.4至约7.0。8.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述多元醇选自山梨醇、木糖醇、甘油及其混合物。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述多元醇包括山梨醇，其中所述山梨醇以约1摩尔/升至约1.6摩尔/升的浓度存在于所述水性组合物中。10.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中水性组合物包含有效量的体细胞提取剂。11.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述体细胞提取剂包括非离子表面活性剂。12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述体细胞提取剂选自聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚和聚乙二醇单烷基醚。13.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述缓冲试剂包括HEPES和Tris琥珀酸盐的混合物。14.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述缓冲试剂以约0.5mM至约200mM的浓度存在于所述水性组合物中。15.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述蛋白质选自血清白蛋白和纯化的胶原蛋白。16.根据前...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克·B·德里斯科尔，
申请(专利权)人：三M创新有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US