一种用于蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的免标记电化学传感检测方法技术

本发明专利技术公开了一种简单、快速、免标记的蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)活性的电化学传感检测方法。我们利用共价固定技术，在半导体电极上构筑PTP的底物(含磷酸化酪氨酸)多肽分子膜，以多肽分子中的酪氨酸作为电化学信号探针，结合电位合适的电子媒介体锇的金属配合物的催化放大功能，建立了一种定量检测PTP酶活性的电化学生物传感器，最低检测限为10nM，该方法也可应用于PTP酶抑制剂和药物分子的快速筛查。该电化学传感方法的最大优势是不需要抗体和信号标记分子，操作步骤简单，非常适合蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的定量检测。

Label free electrochemical sensing detection method for protein tyrosine phosphatase activity

The present invention discloses a simple, fast and label free electrochemical activity detection method for protein tyrosine phosphatase (PTP) activity. We use covalent immobilization technology, build PTP in semiconductor electrodes on the substrate (phosphotyrosine containing peptides) membrane with tyrosine peptide as electrochemical probe signal, catalytic complexes with electronic media potential appropriate body of osmium metal amplification, established electrochemical biosensor for quantitative detection of PTP enzyme activity the minimum detection limit is 10nM, the rapid screening method can also be applied to the PTP enzyme inhibitors and drug molecules. The advantage of the electrochemical sensing method is that the antibody and signal marker molecules are not needed, and the operation steps are simple and very suitable for quantitative detection of protein tyrosine phosphatase activity.

【技术实现步骤摘要】
一种用于蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的免标记电化学传感检测方法
：本专利技术涉及一种可用于免标记检测蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的电化学生物传感方法。该方法操作简单，灵敏度高，可用于蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的定量分析。技术背景：蛋白质酪氨酸可逆磷酸化是真核细胞信号通路调控的重要方式，它通过蛋白质酪氨酸激酶(Proteintyrosinekinase,PTK)的磷酸化作用和蛋白质酪氨酸磷酸酶(Proteintyrosinephosphatase,PTP)的去磷酸化作用共同调节，真核生物细胞通过这种可逆的平衡来调节细胞内及细胞间通信(参见文献LimW.A.etal.Cell,2010,142(5):661-667.)。与PTK相比，对PTP的研究起步较晚，直到近二十年，人们才逐渐认识到它在人类健康和疾病中的重要性。PTP种类众多，广泛表达于各种组织和细胞类型中，已确认的PTP家族成员共有100多个，PTP对PTK及其介导的下游一系列信号途径均有调控作用，其调控的信号途径涉及细胞增殖、分化、粘附、迁移、凋亡、细胞周期等诸多方面(denHertogJ.etal.FEBSJ.,2008,275:831-847.)。尤其在控制细胞磷酸化酪氨酸水平上，PTP起着高度特异性的积极作用，占据了主导地位。PTP家族是信号传导途径中重要的调控因子，并且有相当数量的PTP在人类疾病中起着重要作用，PTP异位表达、异常表达、片段缺失和点突变所引起的功能紊乱与多种疾病甚至癌症的发生发展密切相关。如：血细胞专有的蛋白酪氨酸磷酸酶(Hematopoieticproteintyrosinephosphatase,HePTP)是最早发现的与癌症相关的PTP之一，其基因位于染色体LQ32.1上，研究表明白血病前期骨髓增生异常综合症和急性髓细胞白血病患者体内的HePTP表达过量(ZankeB.etal.Leukemia,1994,8(2):236-244.)；SHP-1是造血细胞生长信号通路的负调节因子，其低表达会导致骨髓细胞发育异常综合症和淋巴瘤的发生(ZhangQ.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2005,102(19):6948-6953.)，但是在卵巢癌中发现SHP-1的过表达；与骨架蛋白同源的磷酸酶PTEN，作为肿瘤抑制基因，可显著抑制多种肿瘤细胞的增殖、粘附、铺展、迁移和抗凋亡(SuzukiA.etal.CancerSci.,2008,99(2):209-213.)，PTEN基因突变或缺失会诱导肿瘤的发生，在食管癌中发现PTEN的缺失，在乳腺癌和前列腺癌中发现PTEN的表达水平低，并且PTEN点突变会引起一些遗传性疾病，如多发性错构瘤综合症、小脑发育不良性神经节细胞瘤；肌管素蛋白MTMR2的缺失会损害周围神经系统髓鞘生成的第一阶段，从而引起神经性肌萎缩综合症(ChojnowskiA.etal.Neurobiol.Dis.,2007,26(2):323-331.)；白细胞抗原相关蛋白(leukocyteantigen-relatedprotein,LAR)属于受体型PTP，乳腺癌中发现LAR的过表达(YangT.etal.Mol.Carcinogen.,1999,25(2):139-149.)，LAR的基因突变与人类结肠癌的发生密切相关；SHP-2的基因突变可引发多种疾病的发生，如努南综合症、豹纹症、青少年单核细胞性白血病等(MullerP.J.etal.J.Proteomics,2013,84:132-147.)，并且SHP-2功能失调会导致一些癌症的发生，如胃癌、肾癌等；CD45参与T、B细胞系和NK细胞的信号传导过程及淋巴细胞的发育和功能调节，它的表达异常会导致免疫系统的病变(AlexanderD.R.etal.Semin.Immunol.,2000,12(4):349-359.)；PTPRJ(Proteintyrosinephosphatase,receptortypeJ)在结肠癌中(RuivenkampC.A.L.etal.Nat.Genet.,2002,31(3):295-300.)，PTPRO(Proteintyrosinephosphatase,receptortypeO)在肝癌和结肠癌中都发现表达量低(MotiwalaT.etal.Oncogene,2003,22(41):6319-6331.)；低分子量PTP和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)参与了生长因子受体和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)的信号通路，与心脏肥大症相关；许多实体肿瘤如晚期结肠癌、肺癌中都发现有PTPα的异常表达(StebbingJ.etal.Oncogene,2014,33(8):939-953.)。基于PTP在生物体内的重要作用，以PTP作为治疗靶点的药物也相继问世，治疗机制是对相应的PTP活性进行调节(VintonyakV.V.etal.Curr.Opin.Chem.Biol.,2009,13(3):272-283.)。如PTP1B使胰岛素受体去磷酸化，是胰岛素信号通路的关键负调节因子，以PTP1B为治疗靶点开发的药物可用于治疗II型糖尿病和肥胖症。虽然与疾病相关的PTP异常的研究已取得了一些进展，但是有关PTP活性的研究手段仍十分有限，进而导致针对其活性调控的小分子药物的研发和筛选等方面的研究，举步维艰。PTP活性测定问题亟待解决，它将为以PTP为治疗靶标的药物研发提供科学依据和实验数据。目前研究PTP活性已有的检测方法主要有荧光法(SahooH.etal.J.Am.Chem.Soc.,2007,129(51):15927-15934；FreemanR.etal.Nano.lett.,2010,10(6):2192-2196；WangF.F.etal.Chem.Commun.,2014,50(60):8161-8163.)、毛细管电泳(CE)(PhillipsR.M.etal.Anal.Chem.,2014,86(2):1291-1297.)和ELISA(BoseA.K.etal.Mol.Cell.Proteomics,2013,12(3):797-806.)等。荧光法是利用底物磷酸化酪氨酸残基去磷酸化前后与荧光标记基团作用的差异导致体系信号的改变来检测，但是涉及到较复杂的化学合成。毛细管电泳法主要根据荧光标记的底物去磷酸化前后，电迁移速率的差异把它先分离出来，但是需要和激光诱导荧光法联用，操作较繁琐，耗时长。ELISA是基于免疫沉淀技术先用抗体捕获目标蛋白，然后再加入酶底物，利用水解下来游离的磷酸根与显色剂反应来检测。但是抗体的制备、纯化以及是否容易获得等因素会制约方法的使用。综上所述，虽然已经发展了一些蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的分析检测方法，但是这些方法还存在着诸多缺陷，不能满足实际要求，有待于新方法和新技术的进一步研究与开发。
技术实现思路
：本专利技术主要是针对现有技术以下几个方面的不足进行了改进：1)现有荧光法涉及到酶底物荧光基团标记较复杂的化学合成；2)毛细管电泳需要和其他方法联用，且操作繁琐耗时；3)ELISA受抗体的制备、纯化及是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的免标记电化学传感检测方法，核心部件传感芯片涉及到将含磷酸化酪氨酸的多肽分子共价固定于半导体电极表面，以酪氨酸为电化学探针，引入电子媒介体锇的金属配合物，利用正常酪氨酸和磷酸化酪氨酸电催化信号的差异，实现对蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的检测。

【技术特征摘要】
1.一种用于蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的免标记电化学传感检测方法，核心部件传感芯片涉及到将含磷酸化酪氨酸的多肽分子共价固定于半导体电极表面，以酪氨酸为电化学探针，引入电子媒介体锇的金属配合物，利用正常酪氨酸和磷酸化酪氨酸电催化信号的差异，实现对蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的检测。2.根据权利要求1所述的半导体电极，其表面需要先用硅烷化试剂进行功能化修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨郁，郭良宏，任肖敏，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11