一族新的灵长类造血生长因子制造技术

本发明专利技术通过重组技术提供一族新的灵长类ＩＬ－３样多肽。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一族新的灵长类IL-3样造血生长因子，以及用遗传工程重组技术生产这种造血因子的方法。红细胞生成素，即造血生长因子，是促进造血细胞生存，生长和分化的蛋白。集落刺激因子(CSFS)是这些造血生长因子的子集，其特征在于能够维持造血细胞集落在体外生长，这些造血细胞起源于骨髓，胎儿肝脏，和其它造血器官的祖先细胞。某些红细胞生成素的生物化学和生物学鉴定和特性描述受到少量天然存在因素的阻碍，这些因素的来源如血液和尿。最近已经分子克隆了某些这种红细胞生成素，进行异种表达并纯化为均一性。[D.Metcalf，“The Molecular Biology and Functions of the Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factors”，Blood，67(2)257-267(1986).]其中红细胞生成素是人和鼠的GM-CSF，人的G-CSF，人的CSF-1和鼠的IL-3。已经证明人的GM-CSF[R，Donahue et.al.，Nature，321872-875(1986)]，鼠的IL-3[J.Kindler et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，831001-1005(1986);Metcalfetal.，Blood，6846-57(1986)]和人的G-CSF[K.Welteet al.，J.Exp.Med.，165941-948(1987)]在体内对红细胞生成有效。在此之前已经发现鼠蛋白IL-3在人的系统中没有复制。[D.R.Cohen et al.，Nucl.Acids Res.，143641(1986).]。本专利技术提供一族基本上没有其它灵长类蛋白的灵长类IL-3样生长因子，其特征是肽序列相同于或基本相似于下面表Ⅰ和Ⅱ中所示的氨基酸序列。这些序列可用表中所示的DNA序列或能够与多肽杂交和编码具有IL-3样生物学特性的多肽的序列或其它各种各样可证实这种特性的修饰序列所编码。这些多肽也以IL-3样生物学特性为特征。作为一个实例，本专利技术提供一种基本上不与其它人的多肽结合的人的多肽，其特征为肽序列与表Ⅱ所示的序列相同或基本相同并至少具有一种IL-3样生物学特性。作为本专利技术多肽的另一实例的是基本上不与其它灵长类多肽结合的长臂猿多肽，其特征为肽序列与表Ⅰ所示的序列相同或基本相同并至少具有一种IL-3样生物学特性。本专利技术多肽的特征在于至少具有一种IL-3样特性，这些特性如下a.用还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得表观分子量约为14～35千道尔顿;b.在标准人骨髓测定中能够以10-100微微克分子的浓度刺激各种谱系的多种类型造血细胞集落的形成;c.在CML测定中能够以10-100微微克分子的浓度刺激CML细胞增殖;d.等电点为pH6.0～pH7.6;e.在Superose 6凝胶过滤柱上43kd处有一个单一的尖峰;f.在N-聚糖酶处理之后的凝胶上有一个单一的20.5kd的条带;和g.对用Edman降解法分析N-末端的污染水平不大于2%。另外，本专利技术提供含有有效治疗剂量的一种或多种本专利技术的多肽的药用组合物。这些组合物可用于治疗许多疾病的方法，这些疾病的特点是缺乏造血细胞。按照本专利技术的这些方法需要给病人服用有效量的至少一种在此所述的多肽。这样的治疗方法可用于治疗下列疾病，如白细胞减少，血小板减少，贫血，B细胞缺乏，T细胞缺乏，细菌感染和病毒感染，包括在骨髓移殖之后免疫细胞或造血细胞缺乏。本专利技术的这些方法还可包括与IL-3样多肽同时或相继服用有效量的至少一种其它的红细胞生成素，白细胞介素，或生长因子。作为这种应用的典型的红细胞生成素包括GM-CSF，G-CSF，CSF-1或促红细胞生成素。典型的白细胞介素是IL-1，IL-2，IL-4或IL-6。这些方法也可使用生长因子(如B细胞生长因子)，B细胞分化因子，或嗜曙红细胞分化因子。本专利技术的再一方面是可在表达基础上编码具有至少一种IL-3样生物学特性的灵长类多肽的DNA序列。这样的序列包括表Ⅰ或Ⅱ中所示的在5′-3′方向上的核苷酸序列。此外本专利技术还包括在严格条件下可与表Ⅰ或Ⅱ的DNA序列杂交的DNA序列或者在非严格条件下可与所述DNA序列杂交的DNA序列，该序列可在表达基础上编码具有至少一种IL-3样生物学特性的蛋白。表Ⅰ和Ⅱ序列的等位基因变异，无论这样的核苷酸变化是否引起肽序列的变化，连同它的其它类似物和衍生物也都包括在本专利技术中。本专利技术的另一方面是含有如上所述DNA序列的载体与表达控制序列有效的结合。这样的载体可用于生产灵长类IL-3样多肽的新方法，其中用编码IL-3样多肽表达的DNA序列转化的细胞系与表达控制序列有效的结合进行培养。所述的这种方法可使用许多已知细胞作为宿主细胞来表达多肽。目前较好的细胞系是哺乳动物细胞系和细菌细胞。通过对下面的较好实施例进行详细叙述，本专利技术的其它方面和优点将更加清楚。本专利技术所提供的这族灵长类IL-3样生长因子基本上不与其它灵长类的蛋白质结合，其特征在于氨基酸序列与下面表Ⅰ和Ⅱ所示的序列相同或基本相似。这族新的生长因子各成员的特征也是具有至少一种IL-3样生长因子的生物学特性，如下所述。最好证明这族本专利技术的生长因子中的任一成员具有一种以上的IL-3样生物学特性。在此定义“IL-3样生物学特性”一词包括一种或多种下列生物学特点和在活体内及体外的活性。一种这样的特性是维持供给红细胞样，淋巴样，和髓样谱系的祖先细胞的生长和分化。例如，在标准人骨髓测定中，IL-3样生物学特性是粒细胞型集落和红细胞样裂解的刺激作用。另一这样的特性是与早期多潜在干细胞相互作用。IL-3样生物学特性是维持多能前体细胞的生长。另一特性是能够刺激慢性骨髓白血病(CML)细胞增殖。IL-3样生物学特性也可刺激肥大细胞的增殖。IL-3样生长因子还可维持依赖各种因子的细胞系的生长和(或)诱导20-α-甾类脱氢酶(20-α-SPH)和Thy-1抗原的表达。IL-3样的另一生物学特性是刺激KG-1细胞集落形成和(或)刺激在脾骨髓培养物中组胺合成的增加。IL-3还有一种生物学特性就是用还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测得表观分子量约为14～35kd。IL-3的其它生物学特性已在本领域揭示了。表Ⅰ和Ⅱ所示的特定的肽序列是本专利技术生长因子族中的两个典型的成员。表Ⅰ的865bp DNA序列是从无尾长臂猿白血病病毒感染的长臂猿T-细胞系UCD-144-MLA的c DNA表达库分离出来的[T.G.Kuwakami et al.，Nature，235170(1972)]。该序列含有一个单一的456个核苷酸的长开放阅读骨架，它编码大约152个氨基酸的蛋白质，称为CSF-80，并且通过高度疏水序列(leu leu leu leu gln leu leu)表明该序列包含一个常规前导分泌序列。成熟蛋白质开始于表Ⅰ中的第20号氨基酸，即丙氨酸。编码区含有3个半胱氨酸，两个在成熟蛋白质中，由此表明有一个二硫键。通过特征序列Asn-X-Ser或As本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基本上不与其它人的多肽结合的人的多肽，其特征在于肽序列与表Ⅱ所示的序列相同或基本相同并具有至少一种ⅠＬ－３样生物学特性。

【技术特征摘要】
US 1987-3-4 021,865;US 1986-7-14 885,060;US 1986-8中。权利要求1.一种基本上不与其它人的多肽结合的人的多肽，其特征在于肽序列与表Ⅱ所示的序列相同或基本相同并具有至少一种ⅠL-3样生物学特性。2.一种基本上不与其它灵长类多肽结合的灵长类多肽，其特征在于肽序列与表Ⅰ所示的序列相同或基本相同并具有至少一种IL-3样生物学特性。3.按照权利要求1或2所述的多肽，其中所述的特性选自下列一组a.用还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得表观分子量约为14～35千道尔顿;b.在标准人骨髓测定中能够以10-100微微克分子的浓度刺激各种谱系的多种类型造血细胞集落的形成;c.在CML测定中能够以10-100微微克分子的浓度刺激CML细胞增殖;d.等电点为pH6.0～pH7.6;e.在Superose 6凝胶过滤柱上43kd处有一...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬C克拉克，阿格尼斯B希亚利塔，尤昌格羊格，
申请(专利权)人：遗传学研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]