祖细胞在没有细胞因子存在条件下的生长和维持制造技术

本文涉及在缺乏外源性造血生长因子的条件下，造血祖细胞体外培养所用的方法和装置。造血祖细胞在缺乏外源性添加的造血生长因子的条件下进行培养，但祖细胞的数量和／或功能不会降低，同时保持了祖细胞的多能性。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术通常涉及造血细胞，更具体地涉及到造血祖细胞的体外培养方法。
技术介绍
循环的血液细胞，比如红血球、白血球、血小板以及淋巴细胞都是可辨别母体终末分化的产物。在正常的成人中，可辨别母体只在中轴骨骼的骨髓腔中发生末期分化，但有些分化延伸到了邻近的腿节、肱骨及椎骨中。这些母体细胞是从被称为祖细胞的细胞衍生出来的，祖细胞是一种发育极不完全的细胞，祖细胞在诸如甲基纤维素这样的半固体介质中培养1-3星期后可发育到相邻的成熟血液细胞集落中，通过这种方式可对祖细胞进行分析测定。人体骨髓细胞培养物最初被发现具有有限的造血能力，但产生的造血祖细胞数量和成熟血液细胞数量会越来越少，并在6～8星期后停止了细胞生成。而且随后对原系统进行的改动也只取得了微小的改善。这在很大程度上是因为造血祖细胞对环境的依赖性较大，比如对体内存在的基本生成因子(造血生长因子和细胞因子)的依赖性较大(见5,999,703、5,728,851和6,372,210号美国专利)。在以前为促进造血祖细胞体外增殖和分化所做的尝试中，人们对细胞因子在各种基质中的效果进行了考察，包括对细胞因子在预先放入造血祖细胞的基质和纤维结合蛋白中的效果进行了考察。在培养环境加入外源性生成因子，特别是白细胞介素-3(IL-3)和粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)可导致造血祖细胞有选择的向特定的分化方向扩增。这些发现表明，在造血祖细胞培养物中加入外源性生长因子可以导致原始造血祖细胞发生分化，并因此消除了未发育完全的造血祖细胞集落，从而对原始造血祖细胞造成了不利的影响。其他的方法是使用经过放射性物质照射过的骨髓基质来培养和维持造血祖细胞，这些其他方法可使这些祖细胞成为长期培养的引发细胞(这些细胞是未发育完全的细胞)，并通过逆转录酶病毒载体来增加造血祖细胞和长期培养的引发细胞的转导作用。但是，在非自体骨髓移植的感染以及免疫反应方面又出现了问题。纤维结合蛋白是一种细胞基质成分，这种蛋白可以降低感染的风险以及免疫调节反应，同时还可增强逆转录酶病毒的转导作用。然而，单独靠纤维结合蛋白不足以在体外维持原始造血祖细胞。骨髓移植后的造血祖细胞扩增是人体骨髓细胞长期培养的一项潜在应用。人类自体骨髓移植和异体骨髓移植目前被用来治疗白血病、淋巴瘤以及其他危及生命的疾病。然而，在这些疾病的治疗过程中，为了取得足够的植入细胞，必须要从捐献者体中移取大量的骨髓细胞，即便如此，经常也会得不到足够数量的细胞。一种可使造血祖细胞扩增的方法降低了骨髓细胞捐献量，这种方法可使少量捐献的骨髓细胞在体外进行祖细胞扩增，然后再注入到骨髓接受者体中。人们还知道，少量的造血细胞会随血液进行循环。如果选取这些造血祖细胞并使其扩增，则有可能从周边血液中获取移植所需的造血祖细胞，并由此消除了骨髓捐献的必要性。造血祖细胞的扩增有助于患者在经历化疗和放疗后的身体恢复，造血祖细胞扩增的另一项应用是用于人类骨髓细胞的长期培养。大多数化疗药剂和放疗手段是通过杀死正在经历细胞分裂的细胞而发挥疗效的。骨髓是人体是多产的组织之一；因此，化疗药物和放疗措施最先损害的器官通常是骨髓。化疗和放疗导致了人体生成的血液细胞在治疗过程中遭到了迅速的破坏。这样，在患者再次接受化疗之前必须要终断治疗，从而使造血系统补充血液供应。一种使造血细胞成功扩增的方法可大大地促进非分化母体细胞大量生成，进而促进具有特定分化方向的分化母体细胞的大量生成，这种结果反过来又为包括输血在内的广泛应用提供了分化造血细胞。目前存在一种需求，这种需求就是在体外培养条件下促进造血祖细胞的成活率和多能性。同时还需要产生大量的分化造血细胞。本专利技术的目标是提供造血干细胞扩增和增殖的方法，同时使造血祖细胞保持自我更新的能力及多能性。本专利技术的另一目标是提供一种方法，该方法对具有特定分化能力的祖细胞以及大量生成更高分化程度的造血细胞过程进行控制。以下将对本专利技术的这些目标及其他目标进行更详细的说明。专利技术概述本专利技术很重要的一部分涉及到培养造血祖细胞的方法，该方法可使造血祖细胞保持自我更新能力以及多能性。因此，本专利技术的一个方面是改善造血祖细胞培养物的保存状况。本专利技术的另一方面是增加从造血祖细胞样本所获得的后代细胞数量。本专利技术的再一方面是增加从造血祖细胞样本所获得的分化后代细胞数量。根据本专利技术，惊奇地发现的是，造血祖细胞可在不加入外源性生长因子的条件下进行培养，这样就避免了祖细胞在培养期间出现分化诱导和/或数量减少。因此，本专利技术可在不加入造血生长因子、接种的基质细胞或基质细胞调节介质的条件下，对造血祖细胞进行体外培养。通过将造血祖细胞植入到只含有血清的培养液中即可实现这一培养过程。使用本领域已知的技术(见5,677,139美国专利，该专利描述了灵长类动物胸腺基质单细胞层上的CD3+细胞的体外分化，见6,372,210号美国专利，该专利描述了支持CD34+细胞增殖和分化的无细胞因子培养液，但为了维持未成熟的显型细胞，需要加入外源性因子)从未取得过这样的结果。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供一种对造血祖细胞进行体外培养的方法。一定数量的造血祖细胞被植入到培养室中。造血祖细胞的培养环境中不含有接种的基质细胞、基质细胞调节介质以及促进分化的外源性造血生长因子，但培养环境中含有血清。造血祖细胞是由以下组织衍生出来的骨髓(包括全骨髓)、周边血液(包括流动的周边血液)、脐带血、胎盘血、胎儿肝脏、胚胎细胞(包括胚胎干细胞)、大动脉—生殖腺—中肾衍生细胞以及淋巴软组织。淋巴软组织包括胸腺、脾、肝、淋巴结、皮肤、扁桃腺以及派伊尔氏淋巴集结(Peyer’s Patches)。在其他实施方案中，本专利技术的方法还包括收集造血细胞的步骤。在第一培养期后有第一次收集。至少在另一培养期后还至少有另一次收集过程，所收集到的细胞然后在至少含有一种外源性因子的环境下进行培养，外源性因子选自于由造血生长因子、接种的基质细胞以及基质细胞调节介质组成的一组物质；其中造血生长因子促进造血细胞的维持、扩增和/或分化，并影响细胞的定位。在某些实施方案中，促进造血细胞维持、扩增和/或分化，并影响细胞定位的造血生长因子可包括白细胞间介素3、白细胞间介素6、白细胞间介素7、白细胞间介素11、白细胞间介素12、干细胞因子、FLK-2配位体/FLT-3配位体、Epo、Tpo、GMCSF、GCSF、制瘤素M和/或MCSF。根据前面所述的本专利技术任何实施方案，本专利技术的方法在所述的第一培养步骤中包括在不含有诸如白细胞间介素3、白细胞间介素6、白细胞间介素7、白细胞间介素11、白细胞间介素12、干细胞因子、FLK-2配位体/FLT-3配位体、Epo、Tpo、GMCSF、GCSF、制瘤素M和/或MCSF这些造血祖细胞生存和增殖因子的环境中对细胞进行培养。正如前面所述的，本专利技术人惊奇地发现造血祖细胞可在不添加任何这些介质的条件下生长。在以往的技术中，为了避免造血祖细胞死亡和/或在培养期间发生分化，通常要加入这些介质。对于引发细胞增殖从而提高干细胞的数量而言，这些介质被认为是必要的。在本专利技术的另一实施方案中，第一培养步骤是在不含任何外源性造血祖细胞生长因子(包括细胞因子)但含有血清的环境下进行的。正如将要理解的，现在根据本专利技术可以在不添加外源性生长因子的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对造血祖细胞进行体外培育的方法，该方法包括：将一定数量的造血祖细胞植入到培养室中；并在不含接种的基质细胞、基质细胞调节介质以及外源性造血生长因子但含有血清的环境中对所述的细胞进行培养；其中造血生长因子促进造血祖细胞的维持、扩增和 ／或分化。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：马克J佩克特，迈克罗森兹维格，托德M厄普顿，
申请(专利权)人：基质细胞有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]