一种用慢病毒在野生型成体小鼠中建立胰腺癌模型的方法技术

一种用慢病毒在野生型成体小鼠中建立胰腺癌模型的方法，包括慢病毒载体的构建，病毒包装、滴度测定及体外验证，病毒注射，及病理鉴定步骤。方法选择人类胰腺癌中变异率最高的癌基因Kras，抑癌基因Tp53、Cdkn2a和Cdkn2b，在同一个慢病毒载体中过表达癌基因Kras

A method of establishing a pancreatic cancer model in wild type adult mice with lentivirus

A method of establishing pancreatic cancer model with lentivirus in wild type adult mice, including lentiviral vector construction, virus packaging, titer determination and in vitro validation, virus injection and pathological identification steps. Methods the highest mutation rate of oncogene Kras, tumor suppressor gene Tp53, Cdkn2a and Cdkn2b in human pancreatic cancer was selected, and over expression of oncogene Kras in the same lentiviral vector.

【技术实现步骤摘要】
一种用慢病毒在野生型成体小鼠中建立胰腺癌模型的方法
本专利技术涉及一种用慢病毒在野生型成体小鼠中建立胰腺癌模型的方法，具体涉及利用慢病毒介导癌基因的过表达及抑癌基因的敲降以诱导小鼠胰腺癌模型的方法，属于动物模型建立

技术介绍
胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，5年生存率为5％左右，是预后最差的恶性肿瘤之一。尽管已有很多关于胰腺癌遗传变异的研究，但是在成体中诱导胰腺癌发生的遗传变异仍未知。考虑到人类癌症(包括胰腺癌)发生的主要原因是成年后遗传突变的累积，因此通过遗传改变在成体动物中诱导的肿瘤模型能更好的认识人类肿瘤的特征。目前应用最多的小鼠胰腺癌模型主要包括KC模型(KrasG12D/Pdx1-Cre)和KPC模型(LSL-KrasG12D/LSL-tp53R172H；Pdx1-Cre)，在这些模型中Kras基因的表达和tp53的突变均开始于早期胚胎时期，而且Kras诱导胰腺癌的能力随着年龄增长而逐渐下降，在成体中完全丧失；并且在成熟的腺泡细胞中Kras也不能诱导明显的肿瘤，甚至再加上Tp53或者Cdkn2a的失活也不能诱导肿瘤形成。现有的胰腺癌动物模型主要包括：基因工程鼠模型、裸鼠移植瘤模型、化学致癌剂诱导模型等；这些模型存在一定的缺陷性：基因表达或变异始于胚胎时期，不能很好地模拟人类疾病的发病机理，诱发周期长、诱发率低等。近年来，慢病毒技术由于具有感染物种局限性小、分裂期和静止期细胞均可有效感染、转移的DNA片段大、目的基因表达时间长等优点，在基因过表达和沉默中获得了广泛应用，包括在体外细胞水平和体内感染等。因此本项目将采用慢病毒技术表达特定的癌基因同时沉默抑癌基因，在完全成年的小鼠中建立胰腺癌模型。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有小鼠胰腺癌模型的不足，提供一种在野生型成体小鼠中建立诱导周期短、诱发率高且稳定、操作简单方便的胰腺癌动物模型的方法。本专利技术选择人类胰腺癌中变异率高的癌基因和抑癌基因，利用慢病毒在胰腺组织中原位表达癌基因、同时敲低抑癌基因，以诱导胰腺癌的发生。本专利技术利用慢病毒载体在胰腺组织中过表达癌基因KrasG12D，同时抑制抑癌基因Tp53、Cdkn2a和Cdkn2b的功能。本专利技术在完全成年的野生型个体中诱导胰腺癌。本专利技术的具体步骤如下：(1)慢病毒载体的构建根据对TCGA数据库的分析，选择人类胰腺癌变异率高的癌基因和抑癌基因，以pTomo空载体为出发质粒，通过一系列常规酶切连接构建表达癌基因，沉默抑癌基因的慢病毒载体。(2)病毒包装、滴度测定及体外验证将构建好的慢病毒载体和包装质粒pCMV8.9、pMD2.G共转染HEK293T细胞，转染6小时后分别在48h、72h收集病毒上清，用25000rpm、4℃离心2.5h浓缩病毒，PBS重悬病毒；QPCR法检测病毒滴度，体外感染小鼠MEF细胞，WB及QPCR检测抑癌基因的敲降效果；(3)病毒注射a.选取野生型成年小鼠，用250mg/kg的Avertin进行麻醉；b.剃毛后用75％酒精对腹部进行消毒，用无菌剪刀在距离胸骨1cm的位置剪开腹腔，创口0.5cm左右，用无菌镊子找到胰腺头部；c.用微量注射器胰头原位注射含0.4％的trypanblue15ul，注射后缓慢拔针，观察病毒液是否泄漏；d.无菌缝合针线进行缝合，内外两层单独缝合，缝合后对伤口再进行一次消毒；(4)病理鉴定待肿瘤形成后，解剖剥取胰腺肿瘤组织，按常规组织病理检测方法进行固定、脱水、包埋，H&E染色检测组织病理特征及肿瘤所属类型，确定慢病毒诱导的小鼠胰腺癌模型属于胰腺导管腺癌。本专利技术具有以下优点和积极效果：1、本专利技术方法相对于以前的小鼠模型，该模型应能更好的模拟人类胰腺癌的发生发展。2、本专利技术方法注射病毒后最快40天即诱发胰腺癌，周期短，且诱发成功率达到100％。3、本专利技术方法克服了以往转基因模型耗时长、成本高及基因改变始于胚胎时期的诸多缺陷。4、本专利技术建立的小鼠的胰腺癌模型能很好的模拟人类胰腺癌的遗传机理，在胰腺癌基础研究及抗肿瘤药物的测试上具有很大的应用潜力。5、本专利技术的方法操作简单快捷，且对实验条件要求不高，普通的细胞分子实验室，动物饲养平台，简易的操作台，普通的手术器械即能完成实验，极易广泛推广使用。附图说明：图1显示TCGA数据库中人类胰腺癌样本中突变率最高的基因及其突变率；图2显示本专利技术构建的慢病毒载体示意图，在同一个慢病毒载体中过表达癌基因KrasG12D，敲降抑癌基因TP53、Cdkn2a和Cdkn2b；图3显示慢病毒载体中shRNA在小鼠MEF细胞中的敲降效率检测，其中TP53敲降率达到83％，Cdkn2a敲降率达到95％，Cdkn2b敲降率达到86％；图4显示小鼠成瘤后的解剖示意图，如图中箭头所指，可以看到小鼠胰腺上有明显的肿瘤；图5显示注射病毒后小鼠的生存曲线，从图中可以看到在注射40天后小鼠就开始发病死亡，而且发病时间较集中；图6显示本专利技术所诱导的小鼠胰腺癌的病理特征及分子特征染色，最主要的病理特征是导管样结构(黑色箭头)伴有丰富的纤维间质(星号)；图7显示本专利技术所诱导的小鼠胰腺癌免疫组化染色,结果表明小鼠胰腺癌中高表达细胞增殖标记Ki67以及人类胰腺癌分子标记，包括CK19、Muc5、Mmp7和Hes1等。根据上述病理及分子特征分析，本专利技术诱导的小鼠胰腺癌应当属于胰腺导管腺癌。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。1、慢病毒载体的构建根据对TCGA数据库的分析，选择人类胰腺癌变异率高的癌基因和抑癌基因，以pTomo空载体为出发质粒，通过一系列常规酶切连接构建表达癌基因，沉默抑癌基因的慢病毒载体。2、病毒包装、滴度测定及体外验证将构建好的慢病毒质粒和包装质粒pCMV8.9、pMD2.G共转染HEK293T细胞，转染后6小时更换新的培养基，分别在48h、72h收集病毒上清，0.45um过滤除去细胞碎片后，用25000rpm、4℃离心2.5h浓缩病毒，PBS重悬病毒；用QPCR法检测病毒滴度，滴度值达到3x10^11；用病毒体外感染小鼠MEF细胞96h后，提取蛋白和RNA，WB检测KRAS的表达非常明显，QPCR检测Tp53、Cdkn2a和Cdkn2b的敲降效果，分别达到83％、95％和86％。3、病毒注射(1)选取野生型成年小鼠，用250mg/kg的Avertin进行麻醉。(2)剃毛后用75％酒精对腹部进行消毒，用无菌剪刀在距离胸骨1cm的位置剪开腹腔，创口0.5cm左右，用无菌镊子找到胰腺头部。(3)用微量注射器胰头原位注射15ul病毒(含0.4％的trypanblue)，注射后缓慢拔针，观察病毒液是否泄漏。(4)无菌缝合针线进行缝合，内外两层单独缝合，缝合后对伤口再进行一次消毒。4、病理鉴定待肿瘤形成后，解剖剥取胰腺肿瘤组织，按常规组织病理检测方法进行固定、脱水、包埋，H&E染色检测组织病理特征及肿瘤所属类型，确定慢病毒诱导的小鼠胰腺癌模型属于胰腺导管腺癌。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用慢病毒在野生型成年小鼠中建立胰腺癌模型的方法，其特征在于选择人类胰腺癌中变异率高的癌基因和抑癌基因，利用慢病毒在胰腺组织中原位表达癌基因、同时敲低抑癌基因，以诱导胰腺癌的发生。

【技术特征摘要】
1.一种用慢病毒在野生型成年小鼠中建立胰腺癌模型的方法，其特征在于选择人类胰腺癌中变异率高的癌基因和抑癌基因，利用慢病毒在胰腺组织中原位表达癌基因、同时敲低抑癌基因，以诱导胰腺癌的发生。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是利用慢病毒载体在胰腺组织中过表达癌基因KrasG12D，同时抑制抑癌基因Tp53、Cdkn2a和Cdkn2b的功能。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在完全成年的野生型个体中诱导胰腺癌。4.根据权利要求1所述的建立胰腺癌模型的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)慢病毒载体的构建根据对TCGA数据库的分析，选择人类胰腺癌变异率高的癌基因和抑癌基因，以pTomo空载体为出发质粒，通过一系列常规酶切连接构建表达癌基因，沉默抑癌基因的慢病毒载体。(2)病毒包装、滴度测定及体外验证将构建好的慢病毒载体和包装质粒pCMV8.9、pMD2.G共转染H...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵旭东，涂秋，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53