一种敲除PD‑1的T细胞制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物与新医药技术领域。公开了一种敲除PD‑1的T细胞制备方法，该技术是利用Crispr/Cas9系统来敲除PD‑1基因。本发明专利技术还涉及Crispr/Cas9技术修饰的T细胞，所述T细胞表面含有PD‑1蛋白，可与癌细胞表面的PD‑L1蛋白结合，阻碍活化T细胞攻击癌细胞。敲除T细胞中的PD‑1基因，打开了免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。

【技术实现步骤摘要】
一种敲除PD-1的T细胞制备方法及其应用
本专利技术涉及生物与新医药
，更具体的说，是一种敲除PD-1的T细胞制备方法及应用。
技术介绍
PD-1(程序性死亡受体1，programmeddeath1)是55KD的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。其胞外区只有1个IgV样区，胞浆区有2个酪氨酸残基，尾部有1个ITIM(immunoreceptortryosine-basedinhibitorymotif)。PD-1可表达于活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞，以及CD4-CD8-胸腺细胞。PD-1有两个配体，PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，均为B7家族中的新成员。PD-1是免疫抑制性受体，与其配体PD-L1、PD-L2相互作用传递抑制性信号，在免疫应答中发挥负向调控作用。T细胞上的PD-1与肿瘤细胞中的PD-L1/PD-L2的结合，可抑制活化的T细胞攻击肿瘤细胞，导致免疫系统不能发挥全部作用，使肿瘤细胞逃逸。CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)，被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器。研究人员发现，它是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼和细菌的基因等。CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。本研究中使用的就是Crispr/Cas9系统。由于PD-1蛋白在免疫应答中发挥负向调控作用，使得部分肿瘤细胞逃避T细胞的攻击，造成肿瘤细胞的扩散。敲除T细胞中的PD-1蛋白，可扩大T细胞的攻击范围，增强T细胞的免疫能力。本研究中利用Crispr/Cas9系统，敲除T细胞中的PD-1基因，使其不表达PD-1蛋白，打开免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。
技术实现思路
本专利技术提供了一个利用Crispr/Cas9系统敲除PD-1基因，表达所述Crispr/Cas9系统的T淋巴细胞，以及所述T淋巴细胞用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。具体包括：(1)pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1质粒构建本专利技术中提供了一个PD-1的靶点基因，利用该靶点构建pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1载体。(2)重组病毒表达载体本专利技术中使用的载体是慢病毒载体pHBLV-gRNA-cas9-GFP，pHBLV-gRNA-cas9-GFP表达基因载体含有一个Cas9蛋白，一个巨细胞病毒的启动子序列(CMVPromoter)和标签蛋白(GFP)及选择性的抗性基因(AmpR)。通过基因合成的PD-1gRNA序列，即目标靶点，在T4连接酶作用下，与线性RNA敲除载体连接，形成完整载体pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1(载体图谱见图1)。(3)宿主细胞本专利技术所用的宿主细胞为一种异质T淋巴细胞——CIK(多种细胞因子诱导的杀伤细胞，cytokine-inducedkiller)。CIK细胞实际上是体外扩增出的以CD3+CD56+为主的异质性细胞群，该细胞群是在多种细胞因子(如OKT-3、IL-2和IFN-γ等)的刺激下，由从外周血分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有极强的溶瘤活性。相对与普通的T淋巴细胞，CIK具有以下优势：①细胞增殖能力强；②杀伤活力强，毒副作用小，无严重不良反应；③杀瘤谱广，不受MHC限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用；④典型的生物治疗模式，通过基因工程方法改良的CIK细胞，可对特定肿瘤进行杀伤。(4)敲除PD-1基因的T细胞的应用途径及剂量本专利技术中敲除PD-1基因的T细胞，是自体的T细胞。所用T细胞的数量为0.5×106～1×109/Kg。通常所用的T细胞的剂量为0.5×106-1.0×107/kg。附图说明图1为pHBLV-gRNA-cas9-GFP的载体示意图。图2是本专利技术外周血单核细胞诱导的CIK倒置显微镜下视野图。图3是本专利技术外周血单核细胞诱导的CIK的表面分子标记CD3+CD56+表达的流式图(CD3表达率为81.6％，CD56表达率为49.5％，双阳性为34.6％)。图4是本专利技术所述的293T细胞明视野图。图5是显微镜下观察pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1转染293T细胞图。图6是荧光显微镜下观察收集的病毒颗粒进行的病毒滴度检测。图7是本专利技术所述慢病毒感染CIK细胞免疫荧光显微镜下视野图。图8是本专利技术所述慢病毒感染CIK细胞后流式细胞术检测其表达率(病毒感染率为12％)。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市面上购买获得的常规产品。实施例1：将基因片段PD-1插入慢病毒表达载体pHBLV-gRNA-cas9-GFP上述PD-1的核酸人工序列，委托汉恒生物科技有限公司合成，插入pHBLV-gRNA-cas9-GFP载体(见图1)，转化到E.coli(TOP10)，经测序正确后，使用OMEGA公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。实施例2：pHBLV-gRNA-cas9-GFP敲除PD-1的T细胞的制备(一)异质性T细胞——CIK的制备取75ml患者外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离出单核细胞。用含有1000IU/mL的重组干扰素γ(购自沈阳三生制药)的CORNING培养基(购自CORNING公司)诱导培养24小时后，加入1500IU/mL的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)和50ng/mL的OKT-3继续培养24小时。每隔三天倍比加液，同时加入5％的自体血浆，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞中的CD3和CD56的阳性表达率(CD3-FITC、CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司)，当CD3+阳性率﹥80％，CD3+CD56+双阳性率﹥20％，视为CIK诱导成功(见图2，图3)，并留取该CIK待病毒感染。(二)慢病毒包装质粒脂质体转染293T细胞从液氮罐中取出冻存的293T细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1～2min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到15mL离心管中，并在其中加上1mL新鲜的完全培养基，混匀后离心，156g，5min。去掉上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀后(使用1mL移液枪重悬细胞，在重悬过程中力度要轻柔，防止将培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除PD‑1的T细胞制备方法，其特征在于：在PD‑1的基因序列中选取19个碱基序列作为靶点，构建pHBLV‑gRNA‑cas9‑GFP‑PD‑1质粒，利用慢病毒包装体系将PD‑1基因包装到慢病毒中，将所述携带PD‑1基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到敲除PD‑1基因的T淋巴细胞。

【技术特征摘要】
1.一种敲除PD-1的T细胞制备方法，其特征在于：在PD-1的基因序列中选取19个碱基序列作为靶点，构建pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1质粒，利用慢病毒包装体系将PD-1基因包装到慢病毒中，将所述携带PD-1基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到敲除PD-1基因的T淋巴细胞。2.如权利要求1所述的一种敲除PD-1的T细胞的制备方法，其特征在于：所述19个碱基序列为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的一种敲除PD-1的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：取患者自身的外周血，分离单个核细胞，用含有重组干扰素γ的LymphocyteSerum-freeMediumKBM551培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素-2和OKT-3诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加含有重组白细胞介素-2的培养基，同时加入5％的患者自体血浆，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记CD3+、CD56+的阳性表达率；当CD3+阳性率>80％...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明录，冯建海，张传鹏，强邦明，金海锋，万磊，韩庆梅，
申请(专利权)人：山东兴瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37