α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶,其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供α－异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，由该酶获得的环四糖，含有该环四糖的糖，及其用途，其中所述酶能从葡糖聚合度至少为２、并具有作为非还原端连接键的α－糖苷键的糖转移α－葡糖基，而实质上不增加还原力，由此形成葡糖聚合度至少为３、并具有作为非还原端连接键的α－１，６糖苷键和作为非还原端以外连接键的α－１，４糖苷键的糖。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,其制备方法和用途的制作方法
本专利技术涉及一种新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(isomaltosylglucosaccharide-forming enzyme)，其制备方法和用途，更具体地说，涉及一种新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，产生该酶的方法，利用该酶的α-葡糖基转移方法，利用该酶和α-异麦芽糖基转移酶两者产生具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖的方法，以及包含这些糖的组合物。现有技术已经知道由葡萄糖分子作为组成糖的糖，例如，从作为原料的淀粉产生的淀粉部分水解物，包括直链淀粉，淀粉糊精，麦芽糖糊精，麦芽寡糖(maltooligosaccharide)以及异麦芽寡糖。并且，已知这些糖在其分子末端通常具有还原性和非还原性基团，和显示出还原性。一般来说，淀粉部分水解物可以用葡萄糖当量(DE)指数表述，该当量是基于干物质的还原力的一种尺度。已知具有比较高的值的那些通常具有比较低的分子量，比较低的粘性，强的甜度和反应性性质，与含氨基的物质(例如氨基酸和蛋白质)的易反应性，其可以引起褐变和产生不愉快的气味，并且容易引起变质。为了改进这些缺陷，长期需要用于降低或消除还原力而不改变葡萄糖分子作为淀粉部分水解物构成糖的方法。例如，在美国化学会杂志，Vol 71，pp.353-358(1949)中公开的方法。已报道了经接触来源于微生物软化芽胞杆菌的淀粉酶从淀粉形成由经由α-1，4葡萄糖苷键连接在一起的6-8个葡萄糖分子组成的α-，β-以及γ-环糊精的方法。现在，这些环糊精以工业规模生产，并利用其固有的性质，例如非还原性，无味以及包裹能力用于不同的领域。如所公开的，例如在日本专利公开143,876/95和213,283/95(由与本申请相同的申请人提出)中公开的那些，已知通过将非还原糖形成酶和海藻糖释放酶与淀粉部分水解物(例如麦芽寡糖)接触，产生由经由α，α-连接键连接在一起的两个葡萄糖分子组成的海藻糖的方法。现在海藻糖已经从淀粉工业化生产，并利用其有利的非还原性，中等和高质量的甜度用于不同的领域。如以上所描述的，具有二个葡糖聚合度(DP)的海藻糖以及具有6-8的DP的α-，β-以及γ-环糊精以工业规模生产，并利用它们有利的性质使用。然而，非-或低-还原糖的类型是有限的，因此需要不同于这些糖的更多不同的糖。前不久，报道了一种由葡萄糖单位组成的环四糖的新类型。欧洲生物化学杂志，Vol.226，pp.641-648(1994)显示了通过将水解酶，alternanase，与经由交替α-1，3和α-1，6键和葡萄糖分子连接的alternan接触，接着在有机溶剂甲醇存在下结晶，形成具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖(本说明书中全文可以称为环四糖)的方法。环四糖和具有环状结构的糖显示出稳定挥发性有机化合物，不引起氨基羰基反应的包含能力。因此，人们期望它们得到使用和加工，少担心褐变和变质。然而，产生该糖所需的原料alternan和alternanase不易获得，并且用于它们的生产的微生物也不易获得。在这样的条件下，本专利技术专利技术人通过将原料具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键(glucosidic linkage)、并且具有至少为3的葡糖聚合度的糖(在说明书全文中可以称为α-异麦芽糖基葡糖基糖)与α-异麦芽糖基转移酶接触，成功地产生了环四糖，该转移酶特异性地水解α-异麦芽糖基部分和其余的葡糖基糖部分，然后将α-异麦芽糖基部分转移到其受体上形成环四糖，如在日本专利申请149,484/2000和229,557/2000中公开的。α-异麦芽糖基转移酶是这样一种酶，其由α-异麦芽糖基葡糖基糖通过α-异麦芽糖基转移反应形成环四糖，并且具有下列物理化学性质 (1)作用从具有至少为3的葡糖聚合度，并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者的糖形成具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖；(2)分子量当在十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上测定时，具有约82,000到约136,000道尔顿的分子量；(3)等电点(pI)当用两性电解质在等电泳上测定时，具有约3.7到约8.3的等电点。(4)最适温度当在pH 6.0下温育30分钟时，具有约45℃到约50℃的最适温度；(5)最适pH当在35℃温育30分钟时，具有约5.5到约6.5的最适pH；(6)热稳定性当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃或更低温度下的热稳定范围；(7)pH稳定性当在4℃温育24小时时，具有在约3.6到约10.0的pH稳定范围。就环四糖的原料糖而言，其从丰富和低价格的淀粉产生应当是合乎需要的，然而，由于α-异麦芽糖基转移酶不直接作用于淀粉，实际上使用了下列方法首先将淀粉转化成具有上述特定结构的α-异麦芽糖基葡糖基糖，例如相对低分子量的异麦芽寡糖，如潘糖和异麦芽糖基麦芽糖，然后在α-异麦芽糖基转移酶的作用下形成环四糖。已经发现，当用潘糖作为环四糖的原料时，基于干固体的重量(d.s.b.)，从原料的产率是约44％。同样地，用异麦芽糖基麦芽糖作为原料的情况下，环四糖的产率约为31％(d.s.b.)，而用淀粉作为原料的情况下，它们应当与酶，例如α-淀粉酶，淀粉脱支酶，β-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶接触，形成相对低分子量的异麦芽糖基寡糖，包括潘糖，环四糖的产率低至约15％(d.s.b.)。虽然从淀粉实际产生环四糖的是可行的(即使具有这样低的产率)，但其生产价格可以是较高的。在这样的情况下，需要建立采用容易得到的原料(例如淀粉)以相对高的产率产生环四糖的新的方法。专利技术描述本专利技术的目的在于提供一种α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其制备方法，可由其获得的环四糖，包括环四糖的糖以及它们的用途。为了达到上述目的，本专利技术专利技术人广泛地筛选了微生物，其产生可用于从淀粉原料以比较高的产率制备环四糖之新酶，期望得到这样一种酶。结果他们意外地发现从土壤分离的芽孢杆菌属或节杆菌属的微生物，如圆孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)C9菌株，圆孢芽孢杆菌C11菌株，圆孢芽孢杆菌N75菌株以及球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)A19菌株(下文称为″菌株C9″，″菌株C11″，″菌株N75″以及″菌株A19″)，它们形成α-异麦芽糖基转移酶(如日本专利申请149,484/2000和229,557/2000中公开的)以及新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(本专利技术专利技术人所追求的)两者。经首先发现以下事实，专利技术人完成了本专利技术通过将相对低分子量的葡糖基糖(包括淀粉部分水解物)与α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶接触，环四糖的产率(本专利技术专利技术人瞄准的目标)可以大大提高；揭示了α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的性质以及α-异麦芽糖基葡糖基糖形本文档来自技高网...

【技术保护点】
α－异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其通过催化从具有至少为２的葡糖聚合度、并且在非还原端具有作为连接键的α－１，４糖苷键的糖转移α－葡糖基，形成具有至少为３的葡糖聚合度、并且具有作为非还原端连接键的α－１，６糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α－１，４糖苷键两者的糖，而实质上不增加还原力。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：久保田伦夫，津崎桂二，东山隆信，福田惠温，三宅俊雄，
申请(专利权)人：株式会社林原生物化学研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]