本文提供的技术涉及具有改进性质的新型微生物葡糖氧化酶变体，更具体地涉及具有葡糖氧化酶活性作为其主要酶活性的多肽；涉及编码所述葡糖氧化酶的核酸分子；含有该核酸的载体和宿主细胞和用于生产该葡糖氧化酶的方法；包括所述葡糖氧化酶的组合物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品饲料加工的方法、用于测量临床样品和生物反应器中的游离葡萄糖的方法和开发微型生物燃料电池的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本文提供的技术涉及具有改进性质的微生物葡糖氧化酶的新变体，更具体地涉及 具有葡糖氧化酶活性作为其主要酶活性的多肽；涉及编码所述葡糖氧化酶的核酸分子；含 有该核酸的载体和宿主细胞和用于生产该葡糖氧化酶的方法；包括所述葡糖氧化酶的组合 物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品饲料加工的方法、用于 测量临床样品和生物反应器中的游离葡萄糖的方法和开发微型生物燃料电池的方法。
技术介绍
葡糖氧化酶（β -D-葡萄糖：氧1-氧化还原酶；EC I. L 2. 3. 4)通过利用分子氧 作为电子受体催化β-D-葡萄糖氧化成葡糖酸，同时产生过氧化氢。微生物葡糖氧化酶近 来因其在化学、药物、食品、饮品、临床化学、生物技术和其它工业领域的多样化应用而备受 关注。近年来对葡糖氧化酶在生物传感器中的新应用的需求增强。葡糖氧化酶已从各种微 生物来源中分离。 黑曲霉（Aspergillus niger)的葡糖氧化酶被用在例如食品加工和制药工业中， 并且用作医学诊断领域中免疫测定和生物传感器的组分。该酶还用于制造可为生物医学植 入物如生物传感器和胰岛素栗供能的微型生物燃料电池。这些装置的输出受到葡糖氧化酶 在阳极室内性能的限制。 特别地，生物燃料电池领域中涉及三种酶学性质：⑴从电极向酶的电子转移速 率（固有酶活性）；⑵酶在生理条件（pH 7. 4和5mM葡萄糖）下的活性；和⑶酶的热稳 定性。 W089/126675记载了重组体系中从黑曲霉生产葡糖氧化酶，W02008/079227 Al涉 及赋予了改进的储存稳定性的从黑曲霉获得的葡糖氧化酶组合物。已公开了不同来源的葡 糖氧化酶，包括海藻类如角叉菜（Chondrus crispus) (US 7544795, US 6924366)、丝状真菌 如枝孢菌属（Cladosporium spp.) (W0 95/29996, WO 1998/020136, US 5834280)和黄蓝状 菌（Talaromyces flavus) (US 6054318)。W02012/017008 Al 公开了与野生型葡糖氧化酶 相比具有改变的酶促效率的黑曲霉葡糖氧化酶的变体。 然而，获得具有针对众多应用的性质改进的葡糖氧化酶将是非常有利的。
技术实现思路
根据本公开的改进的葡糖氧化酶可用于包括从食品和饮品中除去氧、生成过氧化 氢用于防腐、临床样品和生物反应器中游离葡萄糖的测定以及微型生物燃料电池的开发在 内的诸多应用。因此多种工业过程能够受益于根据本公开的葡糖氧化酶的改进变体的使 用。 第一方面，本公开的实施方案提供具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包 括在对应于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶（SEQ ID N0:1)的氨基酸残基T30、I94、A162 位置处的变异，和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、V106、V293或E310位置处的至少 一个或多个其它变异，和其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :1的氨基酸序列至少具 有至少80%的最小序列同一性百分比和/或同源性百分比。 在另一方面，本公开的实施方案涉及选自由下述组成的组的核酸分子： a)编码根据权利要求1至15任一项所述的多肽的核酸分子； b)编码其中一个或多个氨基酸残基被保守性取代的根据权利要求1至15任一项 所述的多肽的核酸分子； cHtSSEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0:12SSEQIDN0:14 所示核酸分子的部分、变体、衍生物或片段的核酸分子； d)或任意核酸分子a)-c)的互补体。 在另一方面，本公开的实施方案涉及包括根据本公开的核酸分子的载体，并涉及 转化、转导或转染有所述载体的宿主细胞。 还在另一方面，本公开的实施方案提供具有葡糖氧化酶活性的多肽的生产方法， 所述方法包括下列步骤：(a)在适合的培养基中在适合的条件下培养根据本公开的宿主细 胞以产生具有葡糖氧化酶活性的多肽；(b)得到所述产生的多肽，和任选地（C)加工所述多 肽。 在另一方面，本公开的某些实施方案涉及包括根据本公开的多肽的组合物，特别 涉及食品组合物、药物组合物、诊断组合物或化妆品组合物。 还在另一方面，某些实施方案提供样品中葡萄糖的测定方法，其中将样品与根据 本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽接触放置，并测定被葡糖氧化酶氧化的葡萄糖的量。 另外，某些实施方案有关于样品中葡萄糖的测定装置和试剂盒，其包括根据本公 开的具有葡糖氧化酶活性的多肽和电子介质（electron mediator)。 此外，某些实施方案涉及酶电极，其具有固定化在电极上的根据本公开的具有葡 糖氧化酶活性的多肽。 另外，某些其它实施方案有关于测定葡萄糖的酶传感器，其包括根据本公开的酶 电极作为工作电极。 在另一方面，实施方案涉及使用根据本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽用于食 品加工。 特别地，在本公开的另一方面的实施方案中，有关于经修饰的葡糖氧化酶，其包括 在来自黑曲霉的天然存在的野生型葡糖氧化酶的氨基酸序列中在相对于来自黑曲霉的野 生型葡糖氧化酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)编号为556和537或37的位置处的至少三个 氨基酸残基的取代，和至少在对应于氨基酸残基556和537或者37和106位置处的取代， 和其中所述经修饰的葡糖氧化酶具有比野生型酶高的固有活性。 在详细说明本公开之前，要理解的是，本公开不限于所记载的装置的特定构成要 件或所记载的方法的工序，因为这些装置和方法是可以更改的。还要理解的是，本文所用术 语仅出于描述特定实施方案的目的，并不意欲受其限制。必须注意的是，如说明书和所附 权利要求书中所使用的，除非上下文中有明确规定，否则单数形式的"一个/ 一种"("a"、 〃an〃）和〃所述/该〃 ("the")包括单个和/或多个参照对象。还要理解的是，如果参数范 围以数值限定给出，该范围视为包括这些极限值。【附图说明】 图1为示出根据本公开的GOx变体在ρΗ5· 5下的酶动力学的图。 图2为示出根据本公开的GOx变体在ρΗ7· 4下的酶动力学的图。【具体实施方式】 本文公开的是葡糖氧化酶（β -d-葡萄糖：氧1-氧化还原酶EC I. 1. 2. 3. 4)的酶 变体，特别是包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的野生型黑曲霉葡糖氧化酶的变体，和编码所 述葡糖氧化酶变体的核酸分子，可用于包括食品加工和药品制造等工业应用，以及医学诊 断领域中免疫测定和生物传感器的组分。酶变体还可用于制造可为生物医学植入物如生物 传感器和胰岛素栗供能的微型生物燃料电池。 特别地，根据本公开的葡糖氧化酶变体与野生型和亲本葡糖氧化酶相比显示改进 的催化效率和/或改进的稳定性能如热稳定性和/或PH稳定性。这些特性使其在工业和 诊断应用中特别有用。 -般而言，本公开有关于具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包括在对应 于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶（SEQ ID N0:1)的氨基酸残基T30和194位置处的变 异，和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、A162、V106、V293 或E310位置处的至少一个或 多个其它变异，和其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包括在对应于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基T30、I94、A162位置处的变异，和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、V106、V293或E310位置处的至少一个或多个其它变异，和其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少具有至少80％的最小序列同一性百分比和/或同源性百分比。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·乌斯塔夫，R·普罗登诺威克，R·费希尔，
申请(专利权)人：弗劳恩霍夫应用研究促进协会，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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