酶法水解黄芩甙葡萄糖醛酸基制备黄芩素的方法技术

本发明专利技术公开一种酶法水解黄芩甙葡萄糖醛酸基制备黄芩素的方法，用酶水解黄芩甙葡萄糖醛酸基，制备黄芩素。克服了现有技术所存在的对黄芩甙破坏性大、污染严重的缺点，具有无污染、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入黄芩甙、黄酮甙、异黄酮甙等产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解黄芩甙葡萄糖醛酸基，更加提高了黄芩素的转化率，对医药、保健食品开发很有意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是属于中药提取方法，尤其是一种酶法水解黄芩甙的葡萄糖醛酸基，制备黄芩素的方法。
技术介绍
黄芩(Baikalskullcap Rood)是常用的中药，是Scutellaria属的根茎。中华人民共和国药典(2000年版)收载了黄芩Scutellaria baicalensis Georgi.，还有粘毛黄芩Scutellaria viscidula，甘肃黄芩Scutellaria rehderiana和慎黄芩Scutellaria amoena等。黄芩中的主要成分是黄芩甙(苷)，含量高达7-19％，只含有微量的汉黄芩甙、黄芩素和汉黄芩素(文献6)。虽然记载黄芩具有消热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功能，可用于治疗上呼吸道感染、泌尿系统感染、菌痢、肝炎、高血压等，也可广泛用于保健食品，但是对疗效起主要作用的是黄芩中所含的微量黄芩素。口服黄芩后，其中的黄芩甙必须在消化系统中变成黄芩素，才能发挥其药效。由于黄芩甙在人体内很难吸收，加之体内转化低(文献1)；而黄芩素容易吸收，生物利用度高(文献2、3)，其药理活性也远高于黄芩甙(文献4)，如抗艾滋病毒、诱导感染鸭子病毒细胞的凋亡，抑制艾滋病毒逆转录酶等作用等均远高于黄芩甙(文献5)。为此，人们致力于研究将黄芩甙变成黄芩素。由于黄芩甙是β-葡萄糖醛酸酶的抑制剂(文献7)，市销的一般β-葡萄糖醛酸酶不能水解黄芩甙β-葡萄糖醛酸基而变成黄芩素，因此曾有人提出利用强酸水解黄芩甙的葡萄糖醛酸基变成黄芩素的方法(中国专利技术专利申请号02129372.4)，但该方法对黄芩甙的破坏较大，环境污染严重。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术所存在的对黄芩甙的破坏较大，环境污染严重的技术问题，提供一种操作简便、无污染、。本专利技术的技术解决方案是一种，用酶水解黄芩甙葡萄糖醛酸基，制备黄芩素。包括如下步骤 a.由微生物发酵制备能水解黄芩甙葡萄糖醛酸基的酶；b.将酶、黄芩甙及缓冲液混合反应0.5～48小时，黄芩甙的浓度为0.01～15％，反应条件为温度5～85℃、PH值2～10；c.提取黄芩素。也可以按如下方法a.在微生物培养基中加入黄芩或黄芩提取物培养；b.收集培养物并用低级醇类溶液浸出；c.提取黄芩素。所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。所述的微生物为细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担子菌。所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵，其产酶诱导物为黄芩甙或黄酮甙或异黄酮甙。所述的缓冲液为醋酸或磷酸。所述的低级醇类溶液为甲醇、乙醇或正丁醇。所述的提取黄芩素为用乙醇沉淀或正丁醇萃取后在碱性条件下溶解，酸性条件下沉淀或乙醇重结晶方法提取。本专利技术是利用能水解黄芩甙葡萄糖醛酸基的酶，水解黄芩中含量较高的黄芩甙葡萄糖醛酸基，制备黄芩素。克服了现有技术所存在的对黄芩甙破坏性大、污染严重的缺点，具有无污染、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入黄芩甙、黄酮甙、异黄酮甙等产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解黄芩甙葡萄糖醛酸基，更加提高了黄芩素的转化率，对医药、保健食品开发很有意义。具体实施例方式实施例1a.以高温好氧菌Bacillus sp.JF2菌(文献8)在含3％玉米粉、0.05％产酶诱导物——黄芩甙培养基中，在温度60℃条件下振荡培养30～90小时，离心除菌、除杂，得含酶混合液，往含酶混合液中加入65％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，用0.02M、pH5醋酸缓冲液透析，离心除杂，冻干，得到黄芩甙酶。b.用0.2克上述黄芩甙酶、3克黄芩甙、150毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)混合均匀，使黄芩甙浓度为0.01～15％，在温度为70℃条件下搅拌反应1～24小时。c.反应后加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，过滤除去蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到2.1克粗品。在热乙醇中溶解、冷乙醇中沉淀，得到纯1.1克黄芩素，经高效液相色谱方法(文献6)检测，纯度为98％。实施例2a.以高温厌氧菌Clostridium thermocopriea JT3-4(文献9)在含4％玉米粉、0.4％大豆浸出物培养基中，在温度60℃条件下，厌氧搅拌培养30～90小时，离心除菌，得含酶混合液，往含酶混合液中加入加入乙醇沉淀酶蛋白，冻干，得到黄芩甙酶。b.3克上述黄芩甙酶、2克黄芩甙、120毫升磷酸缓冲液(0.2M，pH5.0)混合均匀，使黄芩甙浓度为0.01～15％，在温度60℃条件下搅拌反应0.5～20小时。c.反应後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，过滤除去蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到1.7克粗品。在碱性(加NaOH至pH12)中溶解、酸性(加盐酸至pH2)中沉淀的方法精制，得到较纯0.7克黄芩素(文献6)，纯度为90％以上。实施例3a.以黑曲霉菌(Aspegillus niger)在含4％麦芽浸出物、0.5％产酶诱导物——黄芩浸出物的培养基中，在温度28～30℃条件下搅拌，通风培养50～100小时，离心除菌，用60～75％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸铵，离心除渣，即为黄芩甙酶液。b.用3克黄芩甙、100毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)和20毫升上述黄芩甙酶液混合，使黄芩甙浓度为0.01～15％，在20～55℃反应2～16小时。c.加入1/2体积的正丁醇萃取四次，减压蒸干，得到黄芩素粗品2克。经高效液相色谱法检验黄芩素转化率85％，经过乙醇重结晶得到黄芩素纯品1.2克。实施例4a.以米曲霉菌(Aspegillus oryzae)在含5％麦麸浸出物、1％产酶诱导物—黄芩或者其他黄酮类植物的浸出物的培养基中，温度28～30℃条件下，搅拌通风培养50～100小时，离心除菌，加入乙醇至70％沉淀酶蛋白，收集蛋白，加入1/5发酵体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)，即为黄芩甙酶液。b.上述黄芩甙酶液200毫升和黄芩浸出物的溶液800毫升(含浸出物150克)混合，使黄芩甙浓度为0.01～15％，在50℃搅拌反应4小时，70％乙醇沉淀酶蛋白，上清液减压浓缩，得到黄芩素含量高的黄芩浸出物150克左右，经高效液相色谱法检验70％以上的黄芩甙转化成黄芩素。实施例5a.假丝酵母在含黄芩粉10％的麦麸固体培养基(干物1000克)上接种，分装在茄子瓶中30℃固体培养3～8天，收集培养物，在培养基干物中加入6000毫升的生理盐水，浸泡一小时，离心取上清得含酶混合液，加入饱和度60～75％的硫酸铵，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升的pH5、0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析除去硫酸铵，离心除渣，即得500毫升左右的酶液。上述酶液按实施例3的方法处理黄芩甙得到黄芩素。实施例6假丝酵母在含黄芩粉100克和900克麦麸固体培养基上接种，分装在茄子瓶中30℃固体培养2天，明显看到微生物生长，将灭菌的黄芩粉100克平分加入于茄子瓶中，培养5天，收集培养物加入95％甲醇或乙醇或正丁醇20升浸出，过滤，浓缩，加NaOH至pH12溶解黄芩素，过滤，加盐酸沉淀黄芩素，收集沉淀，乙醇中重结晶，得到纯黄芩素6.1克。本专利技术的酶转化化学过程为(GlcAU为葡萄糖醛酸基) 黄芩苷 黄芩素Baicalin Baic本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法水解黄芩甙葡萄糖醛酸基制备黄芩素的方法，其特征在于：用酶水解黄芩甙葡萄糖醛酸基，制备黄芩素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金凤燮，鱼红闪，张春枝，芦明春，车庆明，
申请(专利权)人：金凤燮，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]