酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法技术

本发明专利技术提供一种酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，是用酶水解淫羊藿甙糖基，制备低糖淫羊藿甙或甙元。包括如下步骤：取能水解淫羊藿甙糖基的酶；将酶、淫羊藿甙及缓冲液混合反应１－３６小时，反应条件为温度４－７５℃、ｐＨ值３－９；提取低糖淫羊藿甙或甙元。克服了现有技术所存在的对甙破坏性大，污染大，目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解淫羊藿甙糖基，更加提高了低糖淫羊藿甙或甙元的转化率。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，尤其是一种用酶水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法。
技术介绍
淫羊藿是常用的中药，是Berberridaceae科淫羊藿属(Epimedium genus)植物。中华人民共和国药典(2000年版)收载了如下五种淫羊藿药材，药材为干燥的地上部分。即淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanenes)、朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)等。淫羊藿主要含有异戊烯基取代的黄酮甙(淫羊藿甙)和乙酰基取代的化合物，但是其乙酰基在加工淫羊藿、提取淫羊藿甙的过程中很容易脱掉，因此在淫羊藿中主要含的甙为黄酮甙，即淫羊藿甙。其主要药效为补肾壮骨、增强内分泌，具有激素作用，可促进骨髓细胞DNA合成，促进骨细胞的生长。淫羊藿甙的化学分子结构为 根据分子结构式中不同的R2、R1、R3，淫羊藿甙(苷)分为多种，可按序号排列如下R2R1R3淫羊藿甙(苷)1rha-rha-glc-Me淫羊藿甙(苷)2glc-rha-glc-Me淫羊藿甙(苷)3xyl-rha-glc-Me 淫羊藿甙(苷)4 rha-rha- glc- H淫羊藿甙(苷)5 glc-rha- glc- H淫羊藿甙(苷)6 xyl-rha- glc- H淫羊藿甙(苷)7 rha-rha- H Me淫羊藿甙(苷)8 glc-rha- H Me淫羊藿甙(苷)9 xyl-rha- H Me淫羊藿甙(苷)10 rha-rha- H H淫羊藿甙(苷)11 glc-rha- H H淫羊藿甙(苷)12 xyl-rha- H H淫羊藿甙(苷)13 rha--glc- Me淫羊藿甙(苷)14 rha- glc- H淫羊藿甙(苷)15 rha- H Me淫羊藿甙(苷)16 Hglc- Me淫羊藿甙(苷)17 rha- H H淫羊藿甙(苷)18 Hglc- H4’-甲氧基淫羊藿甙元HH Me淫羊藿甙元 HH H上述不同的淫羊藿甙均有3个糖基，即多糖基淫羊藿甙。多糖基淫羊藿甙活性较低，而低糖基淫羊藿甙或淫羊藿甙元活性却较高，为了得到淫羊藿甙元或者低糖基淫羊藿甙，曾报道过酸碱水解法(孙朋悦等，中国药物化学杂志，1998，30(4)，281-284)，但所述方法对甙破坏性大，污染严重，目的性差。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的技术问题，提供一种酶法水解淫羊藿甙糖基，制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，无污染、目的性强、转化率高。本专利技术的技术解决方案是一种，其特征在于用酶水解淫羊藿甙糖基，制备低糖淫羊藿甙或甙元。包括如下步骤a.取能水解淫羊藿甙糖基的酶；b.将酶、淫羊藿甙及缓冲液混合反应1-36小时，反应条件为温度4-75℃、PH值3-9；c.提取低糖淫羊藿甙或甙元。所述的a步骤可由微生物发酵制备。所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。所述的微生物可为细菌、霉菌、酵母菌，最好用曲霉属霉菌。所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵，产酶诱导物可为黄酮甙或异黄酮甙，可以用含有黄酮甙或异黄酮甙的中草药或者其提取物。所述的b步骤的淫羊藿甙浓度为总反应物体积的0.1-10％。所述的缓冲液为醋酸或磷酸。所述的c步骤为用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。本专利技术同现有技术相比，最大的特点是用酶水解淫羊藿甙糖基来制备低糖淫羊藿甙或甙元。克服了现有技术所存在的对甙破坏性大、污染严重、目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解淫羊藿甙糖基，更加提高了低糖淫羊藿甙或甙元的转化率。具体实施例方式实施例1a.以高温好氧菌Clostridium thermocopriea(文献1)在含3％玉米粉、1％产酶诱导物——淫羊藿浸出物(干物)培养基中，在温度为60℃的条件下，振荡培养30-60小时，离心除菌；往上清液(含酶混合液)中加入65％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，用0.02M、pH5醋酸缓冲液透析，离心除渣，冻干，得到甙酶。b.将0.2克上述甙酶、3克淫羊藿甙1、2、3的混合物或者单体、150毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)混合均匀，使淫羊藿甙1、2、3的混合物占总反应体积的0.1-10％，在温度75℃的条件下搅拌反应1小时。c.反应後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，过滤除去酶蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到2.1克粗品。用高效液相色谱法(文献2)检测结果85％以上的甙转化成单糖淫羊藿甙16、甙元。经硅胶柱分离(文献3)，在热甲醇中溶解、冷甲醇沉淀，得到纯0.1克淫羊藿次生甙13、0.05克单糖淫羊藿甙15和16以及0.02克4’-甲氧基淫羊藿甙元。实施例2a.以高温好氧菌Clostridium thermocopriea(文献1)在含4％玉米粉、0.2％产酶诱导物——淫羊藿浸出物(干物)培养基中，在温度为60℃的条件下，振荡培养30-60小时，离心除菌，往上清液(含酶混合液)中加入乙醇沉淀酶蛋白，冻干，得到甙酶。b.将0.3克上述甙酶、2克淫羊藿甙1、2、3的混合物、120毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)混合均匀，使淫羊藿甙1、2、3的混合物占总反应体积的0.1-10％，在温度为5℃的条件下搅拌反应36小时。c.反应後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，过滤除去酶蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到1.7克粗品。用高效液相色谱法(文献2)检测结果90％以上的甙转化成单糖淫羊藿甙14、17和18。经硅胶柱分离(文献3)，在热甲醇中溶解、冷甲醇沉淀，得到纯0.3克淫羊藿甙14，0.1克淫羊藿甙17和0.1克淫羊藿甙18。实施例3a.以高温好氧菌Clostridium thermocopriea(文献1)在含3％玉米粉、1％产酶诱导物——人参浸出物(干物)培养基中，在温度为60℃的条件下，振荡培养30-60小时，离心除菌，往上清液(含酶混合液)中加入乙醇沉淀酶蛋白，收集蛋白，冻干，得到甙酶。b.将0.4克上述甙酶、2克淫羊藿甙4、5、6的混合物、120毫升磷酸缓冲液(0.2M，pH5.0)混合均匀，使淫羊藿甙4、5、6的混合物占总反应体积的0.1-10％，在温度60℃条件下，搅拌反应18小时。c.反应後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，过滤除去蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到低糖基淫羊藿甙1.5克粗品。经硅胶柱分离(文献3)，在热甲醇中溶解、冷甲醇沉淀，得到纯0.3克淫羊藿甙14、0.1克淫羊藿甙17和0.06克淫羊藿甙元。实施例4a.以黑曲霉菌(Aspegillus niger)在含4％麦芽浸出物、0.5％产酶诱导物——淫羊藿浸出物(干物)的培养基中，在28-30℃搅拌通风培养50-100小时，离心除菌，得含酶混合液，用60-75％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸铵，离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：用酶水解淫羊藿甙糖基，制备低糖淫羊藿甙或甙元。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：鱼红闪，金凤燮，姚新生，
申请(专利权)人：金凤燮，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]