一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种由廉价乳酸钠经多步偶联生物转化制备高价值唾液酸的方法。该方法包括含有乳酸氧化酶菌株的培养、含有唾液酸醛缩酶的大肠杆菌工程菌株即Ｅ．ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１（ｐＢＶ２２０－ＡＬＤ）的构建和培养、Ｎ－乙酰氨基甘露糖胺的制备、利用分别含乳酸氧化酶和唾液酸醛缩酶的完整细胞以廉价的乳酸钠为前体转化合成唾液酸以及通过离子交换分离纯化唾液酸等步骤。本发明专利技术的方法具有成本低廉，操作简单，转化条件要求宽泛，能有效解除丙酮酸钠对乳酸氧化酶的产物抑制等特点。为生物转化法大规模生产唾液酸提供了可能。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种由廉价乳酸钠经多步偶联生物转化制备高价值唾液酸的方法，其步骤顺序如下：　　　　（１）乳酸氧化酶菌种：选择不动杆菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　　ｓｐ．）ＡＴＣＣ１１１７１、假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｓｐ．）ＡＴＣＣ１１４５２之一；　　　　（２）斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为１．５～２．０％琼脂并加有质量体积比为０．２～３％的ＤＬ型或Ｌ型乳酸钠的固体斜面基本培养基上，２５℃～４５℃培养１５～３０小时；　　　　（３）一级种子培养：将步骤（２）培养的菌株，在无菌条件下用接种环接１～２环于２０～１００ｍＬ含有质量体积比为０．２～３％的ＤＬ型或Ｌ型乳酸钠液体基本培养基ＢＬＭ中，２５℃～４５℃条件下，在摇床上振荡培养１０～３０小时，制得一级种子；　　　　（４）扩大培养：以５％体积比的接种量，接一级种子于３００～１０００ｍＬ含有质量体积比为０．２－３％的ＤＬ型或Ｌ型乳酸钠ＢＬＭ中，２５℃～４５℃条件下，在摇床上振荡培养１０～３０小时，制得二级种子；　　　　（５）发酵罐培养：以５％体积比的接种量，接二级种子于１．８～８Ｌ含有质量体积比为０．２～３％的ＤＬ型或Ｌ型乳酸钠的ＢＬＭ中，２５℃～４５℃条件下，培养１５～４０小时，期间以２，４－二硝基苯肼即ＤＮＰ与丙酮酸作用生成棕红色２，４－二硝基苯腙的方法检测细胞酶活，至酶活达到０．９～２．０Ｕ／ｍｌ时，终止发酵培养；　　　　上述的液体基本培养基ＢＬＭ，具体配方按质量体积比是：　　　　ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．１％，Ｋ↓［２］ＨＰＯ↓［４］.３Ｈ↓［２］Ｏ０．０８％，ＮＨ↓［４］Ｃｌ０．１％，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．０５％，ＣａＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ０．００５％，酵母粉０．１％，金属离子混合液０．１２％；调节ｐＨ７．０，１１５℃条件下灭菌２０分钟；　　　　　金属离子混合液的配方如下（ｇ／Ｌ）：　　　　Ｎａ↓［２］ＥＤＴＡ，５０；ＺｎＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ，２０；ＭｎＣｌ↓［２］.４Ｈ↓［２］Ｏ，５；（ＮＨ↓［４］）↓［６］Ｍｏ↓［７］Ｏ↓［２４］.４Ｈ↓［２］Ｏ，１，ＦｅＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ，５；ＣｕＳＯ↓［４］.５Ｈ↓［２］Ｏ，１．５；ＣｏＣｌ↓［２］.Ｈ↓［２］Ｏ，１．６；ＣａＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ，５．５；　　　　（６）收集菌体：取步骤（５）的发酵液５，０００转／分条件下离心５～８分钟，并用生理盐水洗涤２～３次，以相同的离心...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许平，陈净，邱建华，王鹏，马翠卿，张奕南，郗日沫，魏中浩，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]