本发明专利技术涉及一种纤连蛋白与钙粘附蛋白－１１的融合蛋白、制备方法及应用，目的是提供一种可以促进骨和软骨种子细胞与支架材料的粘附的融合蛋白，属于组织工程领域。所述融合蛋白采用将含有ＰＨＳＲＮ和ＲＧＤ基序的ＦＮⅢ↓［７－１０］片段与钙粘附蛋白－１１胞外结构域ＥＣ↓［１－２］制备融合蛋白，进行生物支架材料的表面修饰，充分考虑种子细胞的粘附的“同嗜性”和“异嗜性”，并兼顾种子细胞的粘附和成骨或成软骨分化，建立骨和软骨组织工程生物材料的表面仿生微环境。本发明专利技术适用于组织工程骨和软骨产品的构建及附载细胞的整形材料制作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白制备与应用，目的促进骨和软 骨种子细胞与支架材料复合的粘附，属于组织工程领域。
技术介绍
种子细胞在材料表面上的粘附过程，可分为四个连续发生并相互重叠的变化时相，即 细胞附着、细胞伸展、肌动蛋白细胞骨架的组织以及粘附斑的形成。细胞粘附涉及多种生 物分子，包括细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白以及细胞骨架蛋白的相互联系和相互作用。细 胞和材料的粘附是一个包括多因素的复杂过程，受多种因.素的影响。细胞、材料及其二者 所处的环境，都不同程度地影响细胞与材料的粘附。从材料方面来说，材料表面的理化特 性、几何形状及表面能以及材料的降解活性，都对细胞粘附起关键性作用。如何有目的的 进行组织工程材料的表面修饰以利于种子细胞粘附、增殖及分化是组织工程骨和软骨构建 中要解决的关键问题。细胞表面的粘附受体，主要包括参与同种细胞间粘着结合的表面受体转粘蛋白，主 要以同嗜性方式与细胞一细胞识别相关；整合素以异嗜性方式和细胞一细胞及细胞一细胞 外基质结合有关，由a和p亚基以非共价方式组织成活性二聚体；此外还有选择素和免疫 球蛋白类。在骨细胞和培养的成骨细胞可表达整合素亚单位a2以及纤维连接蛋白受体ci3 ^、 a5e^t1ave3。软骨细胞表面可表达a 5 ^， a ! e卜"0^， a6h， ave3等整合素受体，与纤连蛋白(Fibronectin， FN) ， II型、W型胶原，层粘连蛋 白的以及玻基结合素和骨桥蛋白相结合。整合素在介导锚定过程的同时，还介导跨膜信号 的传递，在粘附斑形成后， 一系列的酶会被激活，包括粘附斑激酶、胞外信号调节酶、有 丝分裂原激活蛋白激酶途径的某些因子等，启动了胞内外信号的传递，触发了细胞的增殖、 迁移、分化、分泌等功能活动，使种子细胞能获得良好的生物学特性。而作为asei配体 的FN属于多糖蛋白，具有粘附细胞的能力，对骨和软骨形成有着重要作用。FN作为ECM 中重要的一种整合素配体，参与细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连，维持细胞正常形态， 促进细胞分化。FN可与胶原结合调节细胞粘附，同时促进成骨细胞系细胞增殖分化并使 成熟成骨细胞存活时间延长。FN还可以与羟基灰石结合调节钙代谢及细胞粘附，对矿化 过程起调节作用。FN在成骨细胞分化时及以后持续表达。有实验证实，FN对磷酸钙陶瓷4的表面修饰能明显提高大鼠成骨细胞的贴附率，有利于成骨细胞的生长及成骨表型。因而 在材料表面接上FN的特异性功能片段，将有助于通过RGD-ash相互作用，促进细胞的粘附。FN与a 5 0 i的结合需要其9号III型重复序列(FNin)的PHSRN基序和9号III型重 复序列的RGD基序参与，这两个基序每一部分对应的连接力较低，但联合作用生物学效 应显著，可以提供稳定的粘附。除了增强细胞-支架的粘附，种子细胞在材料表面的密度决 定着下步分化及成熟的能力，因此需要把把FN片段与已知三维结构并且具有明确粘附功 能和成骨/软骨效应的分子上，而钙粘附蛋白-11 (Cadherin-ll，縮写Cad-11)为一种较佳 的选择。Cad-11属II型钙粘附蛋白，是一种钙离子依赖性介导细胞-细胞间粘附的单链跨膜 糖蛋白，与胚胎肢节形成、骨组织的形成等关系密切，因其最早在成骨细胞系中克隆而来， 所以又称之为成骨细胞型钙粘附蛋白(OB-cadherin)。目前己有学者进行了 Cad-11连接和 粘附特性的精确亚结构域结构的研究。人Cadherin-11是一种由796个氨基酸残基组成的蛋 白质(Okazaki M.， J. Biol. Chem. 1994， 269:12092-8.)，其分子量约为88.0KD。 Cadherin誦ll 在细胞中是以一种含22个氨基酸残基的信号肽和31个前肽的原肽形式合成的，信号肽和 前肽在转运和分泌过程中被切除。在成骨细胞持续表达Cadherin-ll，在胚胎期，Cadherin-ll 限制性的在间质细胞表达。Cadherin-ll最早从原肠胚期仅在中胚层表达，至体节分化后仅 在生骨节表达，影响着成骨细胞分化过程中的细胞排列、聚集及分离，显示Cadherin-ll 在骨骼形成的凝聚中发挥重要功能。2005年Matsusaki等在生长面的软骨细胞中发现了 Cadherin-ll的表达；2007年Agarwal等在小鼠的滑膜囊内发现了 Cadherin-ll的表达，表 明了 Cadherin-ll在软骨形成中也起着重要作用。X线衍射晶体分析法确定了 Cad-11胞外 结构域中Ed区编码蛋白决定粘附的相互作用，即II型的识别特异性主要是在Ed区，Ed 也是钙粘附蛋白单体的重要界面，介导了细胞粘附。基于以上考虑，本专利技术将含有PHSRN和RGD基序的FNIII卜k)片段与Cadherin-ll的 胞外结构域Ed.2的融合蛋白进行生物支架材料的表面修饰，充分考虑粘附的"同嗜性" 和"异嗜性"，并兼顾种子细胞的粘附和成骨，建立组织工程生物材料的表面仿生微环境， 为组织工程骨和软骨的构建提供有力的支持。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术的不足提供一种促进骨和软骨种子细胞与支架材料复合的粘附5分子的设计和应用方法，它可在组织工程化骨、软骨的构建中使用，为生物支架材料的表 面仿生微环境的建立提供了一种有效技术方法。 本专利技术的技术解决方案如下本方法以含有PHSRN和RGD基序的纤连蛋白的FNIII7—K)片段与钙粘附蛋白-ll的胞 外结构域Ed.2的融合蛋白Cad-ll-Ed.2 /FNIII7-1Q，进行生物支架材料的表面仿生微环境 建立，促进种子细胞与组织工程生物支架材料的粘附，步骤如下(1) 融合蛋白的构建将含有PHSRN和RGD基序的FNlIl7-u)片段与成骨细胞特异性钙 粘蛋白胞外结构域Ed.2制备融合蛋白Cad-ll-Ed.2 /FNIII7—10，采用的是EC,-2- (GlySer) n -FNIII7—1G， (GlySer)n是中间所加的一段柔性肽，n为l一3的整数。经生物信息学分析，该融合蛋白中保留了 FNIII7-K)片段与成骨细胞特异性钙粘蛋白表位特征，钙离子结合区保持稳定，各自的空间结构不受影响。融合蛋白具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列和SEQIDNO: 2的核苷酸序列。(2) 融合蛋白的表达、纯化及活性分析Cad-ll-Ed-2/FNHl7—K)表达重组体pet22b-fn-cad 转化入改良大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)，通过氨节青霉素、卡那霉素、氯霉素和四环素4 种抗生素筛选。经过IPTG诱导表达3h，取样行SDS-PAGE电泳分析，分析重组蛋白表达 率和融合蛋白表达形式后，用Ni+珠一步法亲和层析纯化。(3) 融合蛋白在生物支架材料的表面仿生微环境建立将具有生物活性的融合蛋白 Cad-ll-Ed.2/FNni7,进行支架材料表面的附载，常用方式为涂层。本专利技术中所述涂层可 以采用浸涂和喷涂两种方式进行，对于多孔性骨和软骨材料可以采用浸涂方式，以免造成 喷涂的浪费，而对平面材料表面可以采用喷涂，防止因为浸涂而引起的挂膜。(4) 种子细胞在生物支架材料表面的粘附将种子细胞种植在前述融合蛋白修饰的支架 材料上，进行静态或者动态本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纤连蛋白与钙粘附蛋白－１１融合蛋白，所述融合蛋白采用含有ＰＨＳＲＮ和ＲＧＤ基序的ＦＮⅢ↓［７－１０］片段与钙粘附蛋白－１１制备融合蛋白，进行生物支架材料的表面修饰，建立骨和软骨组织工程生物材料的表面仿生微环境；所述融合蛋白命名为Ｃａｄ－１１－ＥＣ↓［１－２］／ＦＮⅢ↓［７－１０］，其具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的氨基酸序列和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董世武，向强，杨波，应大君，张瑗，周跃，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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