重组酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）基因工程菌及使用该菌制备重组aFGF的方法技术

本发明专利技术从人胎脑的Ｑｕｉｃｋ Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ中扩增ｈａＦＧＦ的全编码序列，并对ｈａＦＧＦ的ｃＤＮＡ全序列进行了改造，去掉其５’端５７个碱基，利用大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）高水平表达系统，将ａＦＧＦ基因克隆到ｐＥＴ表达载体上，经转化、筛选、诱导表达，获得高效表达的重组ａＦＧＦ基因工程菌。对于胞内表达产物，采用细胞破碎、离子交换层析和亲和层析纯化，获得高纯度产品。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组人酸性成纤维细胞生长因子基因克隆、改造、基因工程菌的构建及使用该菌制备rhaFGF的方法。一.酸性成纤维细胞生长因子研究现状酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)是第二个被分离纯化的成纤维细胞因子(FGFs)家族成员，最初由Thomas于1984年从牛脑中分离纯化得到。AFGF与从牛垂体中分离到的阳离子多肽bFGF有55％的氨基酸序列相同。AFGF主要分布于脑、垂体、神经组织、视网膜、肾上腺、心脏和骨等器官或组织内，其它组织含量很少，约为1/10～1/50，在血清和体液中以极低的浓度存在。临床研究表明，该因子可促进血管生成、创伤愈合、骨胳修复、眼晶状体再生、溃疡愈合、神经组织的营养和修复、神经突起的生长以及胚胎的发育与分化，有着诱人的临床应用前景。1 aFGF的基因及其mRNAaFGF基因定位于人的第5对染色体上(5q31.3-33.2)，基因长度至少19kb，为单拷贝基因，呈不连续状态，其功能区被两个内含子隔开分为三个外显子区域。Ayalew Mergia的研究工作表明，aFGF的mRNA有4.2kb、3.2kb、2.7kb、1.2kb、0.8kb几种形式，其中长4.2kb的mRNA最常见，数量也较多。不同的转录本的形成可能具有组织、发育特异性。2 aFGF的结构2.1氨基酸序列AFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的阴离子多肽，分子量为16KD，等电点呈酸性(PI5-6)，已证实haFGF的功能区和活性区都集中在分子的C端，N端丢失多至20个氨基酸残基对它的生物学活性都不会产生显著影响。AFGF的氨基酸序列中有三个半胱氨酸残基(Cys)。与许多含Cys的胞外蛋白一般都通过形成二硫键来稳定结构不同，aFGF的Cys残基间不形成二硫键。用定点突变技术将Cys转变为中性氨基酸，如丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)，能增加haFGF对热、酸及某些蛋白酶降解的稳定性和生物学活性。Linemeyer等人用点突变的方法将aFGF的3个Cys逐个换成丝氨酸(Ser)，结果发现得到的3个突变体在肝素存在下都保持较高活性。Ortega等人曾报道了aFGF的3个Cys双点突变和三点突变的研究结果，他们发现这些突变体的活性与野生型和单点突变体比较，都有不同程度的增加，这些结果进一步说明了Cys的存在对aFGF活性的抑制作用。Harper JW等曾对aFGF的一些氨基酸残基进行修饰，研究修饰后的aFGF活性的变化，发现第133位的赖氨酸(Lys)甲基化后，aFGF与肝素及细胞表面受体的亲和力、促分裂活性均下降。他们又用凝血酶处理aFGF，打开C端的Arg137-Thr138肽键，释放一个18残基的肽段，剩下的14KD肽对肝素的亲和力以及促分裂活性都显著降低。他们由此提出，Lys133乃至C端区在aFGF与肝素及受体的结合中起重要作用。2.2三维结构AFGF的二级结构包括β-折叠和β-转角，不含α-螺旋结构，整个分子呈β-三叶草型结构。Michael Blaber于1996年首次测定了aFGF的X-ray晶体结构，通过比较，发现人aFGF、bFGF与牛aFGF三者间，形成疏水核的相关残基严格保守，包括Leu29，Leu38，Leu59，Ile71，Leug0，Phe100，Tyr112，Val124和Phe147。AFGF的高亲和力结合部位主要由以下氨基酸残基构成Tyr30，Arg50，Asn107，Tyr109，Leu148和Leu150，AFGF的这一部位与bFGF的结构非常相似。再比较它们的低亲和力结合部位，发现这一部位位于β8与β9折叠间，两者的长度及序列均不同，AFGF的低亲和力结合部位由115～121共七个氨基酸残基组成，即Lys-Lys-His-Ala-Glu-Lys-His，而bFGF的相应部位由五个氨基酸残基组成Arg-Lys-Tyr-Thr-Ser。可见，AFGF与bFGF的高亲和力结合部位结构保守，用于提供与受体结合所需的大量能量；而低亲和力结合部位结构差别较大，主要是决定与受体结合的特异性。3 aFGF的生物学效应AFGF是迄今为止已知的作用最广泛的生长因子。世界各国的众多学者对aFGF的生物学效应进行了广泛深入的研究。总结近十几年在这方面的研究成果，aFGF的生物学功能主要有以下几方面3.1作为血管生成因子研究表明，aFGF可以直接参与新生血管的形成。在体外观察aFGF对心肌微血管内皮细胞(CMEC)生长的影响，发现在含0.4％小牛血清的培养液中存有微量的aFGF(10-20ng/ml)时，CMEC的3H-TdR掺入率即有增加，表明细胞核内DNA合成增加，aFGF有促CMEC增殖作用，作用呈剂量依赖性。aFGF对血管内皮细胞有较强的趋化作用和促增殖作用，并刺激血管内皮细胞产生胶原酶和纤维蛋白溶解酶原激活物(t-PA)，进一步降解基底膜，同时诱导毛细血管内皮细胞形成管腔样结构。3.2促细胞分裂和分化作用体内体外实验表明，aFGF对多种类型细胞具有促分裂活性，aFGF对3T3成纤维细胞的促有丝分裂实验现已是检测aFGF生物学活性的经典方法。在烧伤创面应用aFGF后，免疫组化染色及显微镜观察显示，aFGF组的表皮细胞和全厚层皮肤组织的DNA含量高于生理盐水对照组，S期细胞数也明显高于对照组，表明aFGF可促进表皮细胞的有丝分裂，，从而促进表皮细胞的增殖，加速创面的愈合。aFGF对中胚层及神经外胚层细胞的分化有明显的刺激作用。在培养的大鼠神经前体细胞中加入aFGF后，出现胆碱能成份分裂并增殖。成神经细胞的分裂受aFGF的调节，分裂过程中出现轴突突起生长出生长锥、神经递质合成、递质小泡的转运等神经元特征。3.3对神经系统的作用实验表明，许多神经元受慢性神经退化变性疾病的影响，如肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)，影响运动神经元；帕金森疾病，影响黑质中的神经元；早老性痴呆，影响基底前脑副交感神经元。这些神经元中都有大量的aFGF分布，aFGF可作为自分泌神经营养因子，感受细胞质膜哪怕是瞬间的渗漏，并立即启动修复，促进神经细胞的迁移和纤溶酶活剂的释放，增加髓磷脂相关蛋白和类脂的含量，改变神经细胞的典型的细胞进程和细胞膜结构，使神经元免受神经退化变性疾病的影响。aFGF能延长培养液中多种中枢和外周神经元的存活，使神经元成活时间增加和其轴突延长。Koshinaga等研究了脊髓损伤后aFGF的表达情况后，发现前角运动神经元的aFGF含量增加，表明机体自身产生大量aFGF，在脊髓损伤的自我修复和再生中起作用，这是机体的一种自我保护机制。4 aFGF的临床应用前景4.1神经系统疾病AFGF作为神经营养因子，在多种疾病中都表现出神经保护作用，修复损伤的神经元。此外aFGF还能调节其他神经递质的生成，如儿茶酚胺(CA)。将aFGF及其激活物质注入多巴胺神经元损伤鼠的纹状体，可使纹状体中酪氨酸羥化酶(TH)的活性及多巴胺水平明显增高，鼠运动失调得到纠正，并且这种作用呈剂量依赖性，但在正常鼠脑中注入这些物质却不能引起多巴胺生化指标的改变，因此，aFGF对损伤的黑质纹状体多巴胺神经系统具有神经化学效应，将来可以作为药物治疗多巴胺失衡的某些神经系统疾病，如Parkinson氏病。4.2缺血性疾病aFGF的本文档来自技高网...

【技术保护点】
能在胞内表达重组酸性成纤维细胞生长因子的基因工程菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李校堃，吴晓萍，郑青，黄亚东，许华，杨晓明，姚成灿，
申请(专利权)人：广州暨南大学医药生物技术研究开发中心，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]