慢病毒载体系统，产生载体的方法及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种能感染或转导分裂或不分裂哺乳动物靶细胞的高安全性的慢病毒载体系统，载体不含有或少含有辅助基因，也不含有或少含有重叠基因组，且所含基因处于Ｔ７启动子和终止子之间或痘病毒启动子和终止子之间：本发明专利技术还公开了一种生产高滴度且安全性好的慢病毒载体的方法，包括构建质粒组，质粒组转导细胞，并用痘病毒感染而获得载体；还公开了慢病毒载体在制备药品或治疗疾病中的应用。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术所属领域本专利技术涉及一种慢病毒载体系统，具体的说，本专利技术涉及能感染或转导分裂或不分裂哺乳动物靶细胞的慢病毒载体系统，载体不含有或少含有辅助基因和重叠基因，以及利用痘病毒产生慢病毒载体的方法以及获得的慢病毒载体在制备药品或治疗疾病中的应用。现在基因传递系统分为两类病毒型和非病毒型。从各种病毒衍生出的病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒、腺病毒相关病毒、picarnovirus、假病毒属等。慢病毒载体被认为是目前最有潜力的用于基因治疗的载体，慢病毒载体通过慢病毒衍生而来。HIV、SIV和FIV等都属于这个家族的。基于HIV的载体是目前研究得最多的一种。它们被证明能在体内高效的转移基因，并能完成传递基因在各种器官中长期表达，像在脑中，视网膜中，肝中和肌肉中。再有它能把基因转移到分化的细胞和未分化的细胞。而且，用这个带有基因地载体可以被简单的注射液传输。最后，这个载体为了达到不同的靶细胞和组织可用各种各样不同类型的包膜蛋白包装成病毒粒子。通过改变胞膜，载体粒子还可以避开先前形成的抗特殊胞膜的抗体。Iwakuma.T.等建立一个HIV-1衍生载体生产系统，包括三个质粒一个包装载体pHP2，一个转化质粒pTV，和一个可编码质粒pHEF-VSV-G。把这三个质粒共转染进TE671人类横纹肌肉瘤细胞一天能产生出105-106感染浓度/每毫升病毒载体。它们修饰了PTV的长重复末端，构建了一个安全的慢病毒生产系统，用切除末端的巨细胞病毒的早期直接增强启动子替代5’端U3，并删除了3’端U3，即使这种优势修饰也有产生衍生病毒的可能。再删除3’端U5则会削弱载体的功能，导致这个系统的安全性都比较低。由Naldini等创立的，并由Dull等发展完善的慢病毒载体系统里，单独编码HIV gag/pol，Rev，VSV-G胞膜蛋白和RNA载体的4个质粒要用于转染293T细胞。当HIV-1前体多聚蛋白gag/pol和Gag在生产载体粒子的细胞表达后，它们接着包装载体RNA并从细胞膜芽裂形成病毒粒子，当VSV-G蛋白与Gag/Pol共表达，得到的质粒将会在其表面存在VSV-G蛋白，这就可以使粒子进入宿主细胞更容易。尽管这个包装系统限制了很多HIV附属蛋白的表达，但由于有几个重叠区，所以有可能引起重组产生复制的活病毒，一个是RRE编码序列，有234bp长，而且存在于载体RNA编码质粒和编码gag/pol的质粒中。第二个是在5’末端编码区域长350bp得到一个含有5’LTR的DNA片断，剪接供体和受体，gag/pol，RRE，和3’段LTR的重组型，可以增加活病毒的复制。再有这个系统需要用4个不同质粒同时进入一个核的可能性比一个或两个质粒同时进入核的可能性低得多，这肯定会减低生产效率。慢病毒载体的报道序列通常只有105的转导区用于小规模的生产。最后，在转染过程中，一些质粒会整合到宿主细胞的染色体上，这个系统用修饰了的细胞系统生产载体粒子，它有从载体生产细胞里得到致癌基因地潜在危险性，并把基因整合到受体细胞的染色体上。中国专利9719888.3采用在启动子位于5’长末端重复序列(LTR)的非慢病毒表达调控元件，且定位于LTR的中间，中国专利97198767.X提出了一种不含有或少含有慢病毒辅助基因的慢病毒载体，既是这样，由于基因间存在着重叠区，存在着回复突变的危险性，另外，各基因间的启动子处于杂乱无章中，影响相互之间的协调，导致产量不高。尽管目前研究的众多慢病毒载体有许多优点，但其缺点是在制备载体的过程中有形成的复制型病毒存在的潜在危险性。这个安全性问题阻碍了慢病毒载体用于人类的基因治疗。另一个问题是很难达到生产载体病毒的高滴度，这样使这个载体系统很难用于治疗。专利技术
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的高安全性的慢病毒载体系统，该系统不含有辅助基因或重叠基因，安全性高。本专利技术的另一个目的是提供一种生产高滴度且安全性好的慢病毒载体的生产方法。本专利技术的再一个目的是慢病毒载体在制备药品和治疗疾病中的应用。一种能感染或转导分裂或不分裂哺乳动物靶细胞的慢病毒载体系统，不含有或少含有辅助基因，其特征是慢病毒载体基因不含有或少含有重叠基因组，且所含基因处于T7启动子和终止子之间或痘病毒启动子和终止子之间。HIV-1病毒的辅助基因包括Vpr，Vif，Tat，Nef，以及其它慢病毒的类似辅助基因，不重叠基因指基因编码序列不重叠，主要是指其结构基因，蛋白基因和调控基因，特别是Rev及U3启动子一种优化的慢病毒载体系统，其慢病毒载体基因包括(1)GAG-POL基因处于痘病毒启动子和终止子之间；(2)VSV-G基因处于T7启动子和终止子之间；(3)载体RNA编码序列处于T7启动子和终止子之间。一种更优化的慢病毒载体系统，其慢病毒载体基因包括(1)来源于HIV-1的GAG-POL基因处于痘病毒启动子和终止子之间；(2)来源于水泡性口膜炎病毒糖蛋白的VSV-G基因处于T7启动子和终止子之间；(3)载体RNA编码序列处于T7启动子和终止子之间，且T7启动子之后连着3个G核甘酸序列，再于R和U5相连。来源于HIV-1的GAG-POL基因最好处于痘病毒PvacE/L启动子和Tvac终止子之间；载体RNA编码序列从5’端到3’端的最佳顺序为T7启动子，3G序列，R，U5，起始子结合位点，包装信号，CMV启动子，增强性绿色荧光蛋白编码区，多聚嘌呤序列(PPT)，U3，3G序列，R，和T7终止子。由于包膜上含有VSV-G蛋白容易引起细胞融合，而且VSV-G蛋白在载体的生产细胞里过量表达，会导致大量的细胞融合，因此采用传统的系统生产载体粒子会降低载体粒子的产量。本专利技术为了抑制VSV-G蛋白在包装细胞中的过量表达，用T7启动子调控VSV-G蛋白表达。在用再用含T7噬菌体RNA聚合酶的痘病毒感染细胞，只有10％T7RNA聚合酶的转录物加了帽，能被宿主细胞的翻译系统表达。用T7RNA聚合酶能抑制有功能的mRNA及其蛋白的合成。再者，在载体RNA编码序列里，直接在T7启动子后设置了三个G，以提高T7RNA聚合酶的转录效率，得到的载体RNA转录物在5’端有三各G，在逆转录过程中，有载体5’端复制的强终止子DNA与载体RNA3’端通过3’R的碱基互补配对退火。为了使逆转录不断进行，在3’U3和R之间需有三个G才能同强终止子DNA 3’末端的3个G互补配对，HIV-1HB株的基因组RNA在3’U3和R中间有3个G。这样的基因结构和独特的质粒，保证了构建载体系统的安全性和载体的高滴度在这个载体系统里依赖含T7RNA聚合酶的痘病毒的转录安全在细胞质中进行，不需要HIV、Tat和Rev那种中间型的反势激活；再有，在包装系统中进行，也不需要U3启动子的功能；这个载体整合到宿主染色体后不会机会宿主细胞的癌基因，减少致病可能。为了克服在用痘病毒复制机制产生病毒载体中的污染感染性的痘病毒的重要问题，最佳方法是采用一个缺少必须基因D13L的缺陷型痘病毒。一种生产慢病毒载体系统的方法，其特征是制备不含有或少含有重叠基因组，且基因处于T7启动子和终止子之间或痘病毒启动子和终止子之间的质粒组，将质粒组转染入宿主细胞，再用含T7噬菌体RNA聚合酶的痘病毒感染已转染质粒组的宿主细胞而获得慢病毒载体。一种优化的生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能感染或转导分裂或不分裂哺乳动物靶细胞的慢病毒载体系统，不含有或少含有辅助基因，其特征是：慢病毒载体基因不含有或少含有重叠基因组，且所含基因处于Ｔ７启动子和终止子之间或痘病毒启动子和终止子之间。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李信墙，
申请(专利权)人：李卫云，于红潮，李一君，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]