来自放射形土壤杆菌P230的磷酸三酯酶制造技术

本发明专利技术提供了能够水解有机磷酸酯（ＯＰ）分子的酶。具体地，本发明专利技术提供了自分离于土壤中的一种放射形土壤杆菌菌株中鉴定的水解ＯＰ杀虫剂的磷酸三酯酶以及编码该酶的基因。本发明专利技术还提供了该鉴定的磷酸三酯酶的突变体，所述突变体具有改变了的底物特异性。此外，本发明专利技术还提供了这些酶在生物补救策略中的用途。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及能够水解有机磷酸酯(organophosphate，OP)分子的酶。具体而言，本专利技术涉及水解OP杀虫剂的磷酸三酯酶(phosphotriesterase enzyme)及其编码基因，该磷酸三酯酶鉴定自由土壤中分离得到的放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)菌株。本专利技术还涉及该鉴定的磷酸三酯酶的突变体，所述的突变体具有改变了的底物特异性。
技术介绍
有机磷酸酯杀虫剂是环境以及一系列日用品中的不良污染物。最具敏感性的领域包括土壤的污染、再循环的灌溉废水的污染(污染的废水被下游的灌溉者使用或直接让其流出农场)、以及在农业和园艺出口商品中存在超标的残余物。有机磷酸酯类中毒是接触此类化学品的农业工人面临的一个问题，对于在化学战中接触有机磷酸酯类的军事人员来说也是如此。此外，战略储备的有机磷神经毒剂也需要进行解毒处理。因此，急需一些生物补救策略来清除或减少此类有机磷酸酯的残余物和/或储备。提出的方案之一涉及使用能够使有机磷酸酯残基固定或发生降解的酶。这些酶例如可被用于生物反应装置通过其能够使被污染的水达到合格，或是用于洗涤溶液中以便在对水果、蔬菜或动物产品进行收获后杀虫能够降低残余物的水平和存留时间。适合用于对有机磷酸酯残余物进行降解的酶包括来自细菌的OP水解酶(Mulbry，1992；Mulbry和Kearney，1991；Cheng等，1999；US 5,484,728；US 5,589,386)、来自脊椎动物的OP水解酶(Wang等，1993；1998；Gan等，1991；Broomfield等，1999)、以及来自OP抗性昆虫的OP水解酶(WO95/19440和WO 97/19176)。符合要求的OP水解酶应该能够快速降解有机磷酸酯残余物。研究得最为深入的OP降解酶是细菌的有机磷酸酯二水解酶(organophosphate dihydrolase，OPD)，其由保藏号为ATCC 27551的黄杆菌菌种(Flavobacterium sp.)和缺陷短波单胞菌MG(Brevundimonasdiminuta MG)(Harper等，1988；Mulbry和Karns，1989)中的不同的质粒上的相同的基因编码。OPD是一种同二聚体蛋白，能够水解很多种磷酸三酯(氧OP和硫OP均可)(Dumas等，1989a，b)。其反应机制直接或间接地涉及金属离子，优选为Zn++。OPD对于磷酸单酯或二酯不具有可检测到的活性(Dumas等，1989a，b；1990)。已经在大肠杆菌(Escherichia coli)(ePHP)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(mtPHP)和肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)(mpPHP)的基因组中鉴定出了OPD同源物(磷酸三酯酶同源蛋白(磷酸三酯酶homology proteins，PHP))，不过，仅对ePHP的磷酸三酯酶活性进行了测试(Scanlan和Reid，1995；Buchbinder等，1998)。在ePHP的组裂解物中未检测到其对任何一种测试的底物具有活性，例如p-硝基苯乙酸酯、双(p-硝基苯)磷酸酯、对氧磷(paraoxon)和p-硝基苯磷酸酯。在脊椎动物中也鉴定出了OPD同源物(Davies等，1997)，尽管其在这些有机体中的功能仍是未知的。OPD、ePHP、mtPHP和哺乳动物的PHP在氨基酸水平具有27-30％的相同性，不过mpPHP的相同性稍低。涉及与Zn++结合的氨基酸残基在迄今为止所鉴定到的磷酸三酯酶家族的六种成员中是保守的(Buchbinder等，1998)。自暴露于OP的细菌中已经分离出另外三种截然不同的OP水解酶(Mulbry和Karns，1989；Mulbry，1992；Cheng等，1999)。其中的两种已经得到了其序列信息，两者之间以及与OPD之间均不相关。一种为来自交替单胞菌菌种(Alteromonas sp.)的氨酰基脯氨酸二肽酶(prolidase)，通常在X-Pro二肽的水解中起作用。研究报道其对于杀虫剂类OP的活性适中，不过其kcat/Km特异性常数尚未被报道(Cheng等，1999)。另一种为来自诺卡氏菌菌种(Nocardia sp.)B-1菌株的芳基二烷基磷酸酯酶(aryldialkylphosphatase)(ADPase)，其对于乙基对硫磷(parathion)的转换数(turnover number)与报道的OPD相比要低4500倍(Mulbry和Karns，1989；Mulbry，1992)。对氧磷酶或PON1是在哺乳动物中发现的一种截然不同的OP水解酶。与OPD相似，其为一种金属酶(其金属离子优选为Ca++)，在血浆中与低密度脂蛋白结合，通常参与对氧化的脂质化合物的代谢(Gan等，1991；Sorenson等，1995)。其对于对氧磷具有高度的活性，特异性常数在106M-1sec-1左右(Doom等，1999；Hong和Raushel，1999)。还有证据显示在大量的脊椎动物、无脊椎动物以及微生物中存在其他的、被称为二异丙基氟磷酸酯酶(diisopropyl fluorophosphatase)(DFPase)的酶(Wang等，1998；Hoskin等，1999；Billecke等，1999)。这些酶在其生化特性的许多方面具有显著的不同，但其共同特征为对于OP类化学武器毒剂都具有水解活性。仅有的一些序列信息提示它们与上述所有其他的OP水解酶均无关联。对OP具有抗性的丽蝇(blowfly)和家蝇是对氧OP样chlorfenvinfos(CVP)和羧酸酯OP样马拉硫磷(malathion)具有活性的酯酶的来源(Newcomb等，1997；Campbell等，1998；Claudianos等，1999；WO 95/19440；WO 97/19176)。将丽蝇酯酶E3(及其家蝇直向同源物(ortholog)，ALI)的第137位残基的Gly以Asp取代导致其具有了对CVP的活性，而将其第251位残基的Trp以Leu/Ser取代的突变导致其产生针对马拉硫磷的活性。但这些酶对其OP底物的特异性常数要较OPD对对氧磷的特异性常数低几个数量级。因此需要更多的能够用于生物补救策略的OP降解酶。
技术实现思路
本专利技术人已经建立了一种快速敏感的蝇毒磷(Coumaphos)(一种硫OP杀虫剂)水解荧光分析法，并用该方法自被污染的土壤中分离出一种能够将OP作为唯一磷源的细菌。16S rDNA测序将该细菌(分离物230)鉴定为放射形土壤杆菌的一种菌株。本专利技术人还已经分离并鉴定了具有这种蝇毒磷水解活性的酶，并提供了该酶在生物补救策略中的用途。在一个方面，本专利技术提供了一种基本上纯化的多肽，该多肽选自(i)包含SEQ ID NO1的序列的多肽；(ii)包含SEQ ID NO2的序列的多肽；(iii)包含SEQ ID NO3的序列的多肽；(iv)包含SEQ ID NO4的序列的多肽；或(v)包含与(i)至(iv)中任一序列的相同性大于90％的序列的多肽，其中所述的多肽能够水解有机磷酸酯分子。优选的有机磷酸酯分子包括，但不限于，蝇毒磷、香豆磷(corox本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基本上纯化的多肽，该多肽选自：　　　　（ｉ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的序列的多肽；　　　　（ｉｉ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２的序列的多肽；　　　　（ｉｉｉ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３的序列的多肽；　　　　（ｉｖ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：４的序列的多肽；或　　　　（ｖ）包含与（ｉ）至（ｉｖ）中任一序列的相同性大于９０％的序列的多肽，　　　　其中所述的多肽能够水解有机磷酸酯分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：艾琳霍恩，塔拉萨瑟兰，丽贝卡哈考特，罗宾拉赛尔，约翰奥克肖特，
申请(专利权)人：联邦科学技术研究组织，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]