用于降解有机磷酸酯的酶制造技术

本发明专利技术涉及能够水解有机磷酸酯(OP)分子的酶。特别地，本发明专利技术涉及来自农杆菌属（Agrobacterium）的OpdA酶的变体，其与天然存在的OpdA相比时显示改进的活性。本发明专利技术也涉及对有机磷酸酯甲基毒死蜱、二嗪农和乙基对硫磷具有有机磷酸酯水解活性的多肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于降解有机磷酸酯的酶
本专利技术涉及能够水解有机磷酸酯（organophosphate）（OP）分子的酶。
技术介绍
有机磷酸酯（OP）杀虫剂残余物是环境以及一系列日用品中不期望的污染物。尤其敏感的领域包括土壤的污染、再循环的灌溉废水的污染（废水被下游的灌溉者使用或允许直接流出农场）、以及在农业和园艺出口商品中存在超出允许水平的残余物。有机磷酸酯中毒是暴露在此类化学品的农业工人面临的一个问题，对于暴露在化学战中所用的有机磷酸酯的军事人员也是如此。此外，储备的有机磷神经毒剂也需要对这些储备进行解毒处理。因此，需要一些生物修复（bioremediation）策略来清除或减少此类有机磷酸酯的残余物和/或储备。提出的一个方案涉及使用能够固定或降解有机磷酸酯残余物的酶。例如，这些酶可用于生物反应器中，污染的水可能会流经所述生物反应器，或是在对水果、蔬菜或动物产品进行收获后杀虫（disinfestation）后用在洗涤溶液中以便降低残余物的水平和存留时间（withholdingtime）。适合用于对有机磷酸酯残余物进行降解的酶包括来自细菌的OP水解酶(Mulbry,1992；Mulbry和Kearney,1991；Cheng等，1999；US5,484,728；US5,589,386;Dong等，2005)、来自脊椎动物的OP水解酶(Wang等，1993；1998；Gan等，1991；Broomfield等，1999)、以及来自OP抗性昆虫的OP水解酶(WO95/19440和WO97/19176)。要求OP水解酶应该能够快速降解有机磷酸酯残余物。研究得最为深入的OP降解酶是细菌的有机磷酸酯二水解酶(organophosphatedihydrolase，称为OPD、OPH或PTE)，其由黄杆菌菌种（Flavobacteriumsp.）ATCC27551和缺陷短波单胞菌MG（BrevundimonasdiminutaMG）中的不同质粒上相同基因编码(Harper等，1988；Mulbry和Karns,1989)。OPD是一种同二聚体蛋白，能够水解很多种磷酸三酯（氧OP和硫OP均可）（Dumas等，1989a,b）。其反应机制直接或间接地涉及金属离子，优选为Co++、也包括Zn++、Cd++、Fe++和其它二价阳离子。OPD对于磷酸单酯或二酯没有可检测到的活性(Dumas等，1989a,b；1990)。已经在大肠杆菌（Escherichiacoli）(ePHP)、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）(mtPHP)和肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae）(mpPHP)的基因组中鉴定出了OPD同源物（磷酸三酯酶同源蛋白，或PHP），不过仅对ePHP的磷酸三酯酶活性进行了测试(Scanlan和Reid,1995；Buchbinder等，1998)。在ePHP的粗裂解物中未检测到对任何测试的底物具有活性，例如p-硝基苯乙酸酯、双(p-硝基苯)磷酸酯、对氧磷（paraoxon）和p-硝基苯磷酸酯。已鉴定出一类相关性更远的蛋白，其具有非常低水平的OP水解酶活性但是高水平的内酯酶活性，同样OPD酶也具有非常低水平的内酯酶活性（小于针对OP底物活性的0.001%）（Afriat等人，2006）。在脊椎动物中也鉴定出了OPD同源物(Davies等，1997)，尽管其在这些生物中的功能仍是未知的。OPD、ePHP、mtPHP和哺乳动物的PHP在氨基酸水平具有27-30%的同一性，不过mpPHP的相似性稍低。在迄今为止所鉴定到的磷酸三酯酶家族的所有成员中，参与Zn++结合的氨基酸残基都是保守的(Buchbinder等，1998)。最近，从农杆菌中（Agrobacterium）分离出OP降解酶（WO02/092803;Horne等，2002;Jackson等，2009）。这种酶又称为OpdA，因其与OPD具有90%的氨基酸序列同一性。尽管OpdA与OPD在氨基酸水平上相关，它们已显示出针对不同OP的不同活性。需要可用于生物修复策略中的其它OP降解酶。特别是，需要针对特定OP具有增强的活性的可用于生物修复领域的酶。
技术实现思路
本专利技术已鉴定的多肽与天然存在的OpdA相比具有改进的活性。因此，在一方面，本专利技术提供一种多肽，其含有序列为如下的氨基酸：i)如SEQIDNO:1所示，ii)与SEQIDNO:1所示的序列至少95%相同，或iii)i)或ii)的片段，其具有有机磷酸酯水解活性和/或其是至少270个氨基酸长，其中，所述多肽包含下列中的一个或更多或全部；a)在与SEQIDNO:1的氨基酸51位相对应位置上的缬氨酸；b)在与SEQIDNO:1的氨基酸63位相对应位置上的丙氨酸；c)在与SEQIDNO:1的氨基酸156位相对应位置上的精氨酸；d)在与SEQIDNO:1的氨基酸203位相对应位置上的谷氨酸；以及e)在与SEQIDNO:1的氨基酸236位相对应位置上的天冬氨酸。在一个实施方案中，所述多肽具有有机磷酸酯水解活性。在另一个实施方案中，所述多肽与第二多肽相比具有更强的有机磷酸酯水解活性，第二多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。更优选地，与氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的多肽、氨基酸序列如SEQIDNO:3所示的多肽以及氨基酸序列如SEQIDNO:4所示的多肽相比，所述多肽具有更强的有机磷酸酯水解活性。在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、优选全部三个的多肽相比，本专利技术的多肽针对甲基毒死蜱具有高至少2倍、或4倍或6倍的二级速率常数(kcat/Km)。在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、优选全部三个的多肽相比，本专利技术的多肽针对二嗪农具有高至少1.5倍或2倍的二级速率常数(kcat/Km)。在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、优选全部三个的多肽相比，本专利技术的多肽针对乙基对硫磷具有高至少2倍、或3倍或4倍的二级速率常数(kcat/Km)。在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、优选全部三个的多肽相比，本专利技术的多肽针对乙基毒死蜱具有高至少1.2倍、或1.5倍的催化常数(kcat)。关于以上四个实施方案，优选地，相对于氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的多肽、氨基酸序列如SEQIDNO:3所示的多肽、以及氨基酸序列如SEQIDNO:4所示的多肽，本专利技术的多肽具有限定的活性。在一个实施方案中，有机磷酸酯是芳香族的非乙烯基（non-vinyl）有机磷酸酯。更优选地，所述有机磷酸酯的离去基团具有低于8的pKa。在一个实施方案中，有机磷酸酯是乙基对硫磷、甲基对硫磷、二嗪农、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱或马拉硫磷。在一个实施方案中，本专利技术的多肽具有对乙基毒死蜱至少约2x106sec-1.M-1、对甲基毒死蜱至少约3.5x105sec-1.M-1、对二嗪农至少约3.6x106sec-1.M-1、对乙基对硫磷至少约9x107sec-1.M-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其含有序列如下的氨基酸：i)如SEQ ID NO:1所示，ii)与如SEQ ID NO:1所示的序列至少95%相同，或iii)i)或ii)的片段，其具有有机磷酸酯水解活性和/或至少270个氨基酸长，其中，所述多肽包含下列中的一种或更多或全部；a)在与SEQ ID NO:1的氨基酸51位相对应位置上的缬氨酸；b)在与SEQ ID NO:1的氨基酸63位相对应位置上的丙氨酸；c)在与SEQ ID NO:1的氨基酸156位相对应位置上的精氨酸；d)在与SEQ ID NO:1的氨基酸203位相对应位置上的谷氨酸；以及e)在与SEQ ID NO:1的氨基酸236位相对应位置上的天冬氨酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.20 US 61/509,810;2011.07.21 US 61/510,3771.一种多肽，其氨基酸序列是：i)SEQIDNO:1所示，或ii)SEQIDNO:5所示。2.根据权利要求1所述的多肽，其具有有机磷酸酯水解活性。3.根据权利要求2所述的多肽，其与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的第二多肽相比具有更强的有机磷酸酯水解活性。4.根据权利要求2或权利要求3所述的多肽，其具有下列中的两种或更多或全部：i)与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的多肽相比，针对甲基毒死蜱高至少2倍的二级速率常数(kcat/Km)，ii)与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的多肽相比，针对二嗪农高至少1.5倍的kcat/Km，iii)与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的多肽相比，针对乙基对硫磷高至少2倍的kcat/Km，或者iv)与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的多肽相比，针对乙基毒死蜱高至少1.2倍的催化常数(kcat)。5.根据权利要求4所述的多肽，其具有：i)与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的多肽相比，针对甲基毒死蜱高至少2倍的kcat/Km，ii)与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的多肽相比，针对二嗪农高至少1.5倍的kcat/Km，iii)与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的多肽相比，针对乙基对硫磷高至少2倍的kcat/Km，和iv)与氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的多肽相比，针对乙基毒死蜱高至少1.2倍的kcat。6.根据权利要求2所述的多肽，其中所述有机磷酸酯的离去基团具有低于8的pKa。7.根据权利要求2所述的多肽，其中所述有机磷酸酯是芳香族非乙烯基有机磷酸酯。8.根据权利要求6或权利要求7所述的多肽，其中所述有机磷酸酯是乙基对硫磷、甲基对硫磷、二嗪农、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱或马拉硫磷。9.根据权利要求2所述的多肽，其具有下列中的两个或更多：i)对乙基毒死蜱至少2x106sec-1.M-1的kcat/Km，ii)对甲基毒死蜱至少3.5x105sec-1.M-1的kcat/Km，iii)对二嗪农至少3.6x106sec-1.M-1的kcat/Km，iv)对乙基对硫磷至少9x107sec-1.M-1的kcat/Km，或v)对甲基对硫磷至少3x106sec-1.M-1的kcat/Km。10.根据权利要求9所述的多肽，其具有：i)对乙基毒死蜱至少2x106sec-1.M-1的kcat/Km，ii)对甲基毒死蜱至少3.5x105sec-1.M-1的kcat/Km，iii)对二嗪农至少3.6x106sec-1.M-1的kcat/Km，iv)对乙基对硫磷至少9x107sec-...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·斯科特，J·奥克肖特，R·拉塞尔，N·弗伦克，S·科措尼斯，刘凯燕，
申请(专利权)人：联邦科学工业研究组织，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU