固氮酶多肽在植物细胞中的表达制造技术

本发明专利技术涉及在植物细胞线粒体中产生固氮酶多肽的方法和手段。酶多肽的方法和手段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】固氮酶多肽在植物细胞中的表达


[0001]本专利技术涉及在植物细胞线粒体中产生固氮酶多肽的方法和手段。

技术介绍

[0002]在酶复合物、固氮酶催化下，固氮细菌通过生物固氮(BNF)由N2气产生氨。然而现代农业的需求远远超出了这种固定氮源，因此工业生产的氮肥广泛用于农业中(Smil，2002)。然而，肥料生产和施用都是污染的原因(Good和Beatty，2011)并且被认为是不可持续的(Rockstrom等人，2009)。世界范围内施用的大部分肥料不被作物吸收(Cui等人，2013；de Bruijn，2015)，导致肥料流失、杂草滋生和水道富营养化(Good和Beatty，2011)。由此产生的藻华降低了氧含量，对当地和整个珊瑚礁的近海造成环境破坏(De'ath等人，2012；Glibert等人，2014；Sutton等人，2008)。此外，尽管在许多发达国家中过度施肥是一个问题，但在某些地区，其可用性限制了作物产量(Mueller等人，2012)。生产化肥本身需要大量的能源投入，估计每年需要1000亿美元。
[0003]显然，需要采取策略减少工业生产的氮依赖性。为此，具有生物固氮作用的工程植物的概念长期以来引起了相当大的兴趣(Merrick和Dixon，1984)，并且一直是最近评论的焦点(de Bruijn，2015；Oldroyd和Dixon，2014)。可能的方法包括i)将固氮生物(diazotrophs)的共生关系从豆类延伸到谷物(Santi等人，2013年)，ii)重建(re
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>engineering)内共生微生物使其能够具有固氮作用(Geddes等人，2015年)，iii)用基因工程将固氮酶植入植物细胞(Curatti和Rubio，2014年)。由于技术上的困难，所有这些方法都是宏伟的和推测性的。
[0004]固氮酶是一种能够在固氮细菌(diazotrophic bacteria)中产生生物固氮作用的酶复合物，它需要一个多基因组装途径来实现其生物合成和功能(Hu和Ribbe，2013；Rubio和Ludden，2008；Seefeldt等人，2009)进行了广泛的综述。典型的铁
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钼固氮酶(iron
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molybdenum nitrogenase)的组件(component)包括称为NifD和NifK的催化蛋白和电子供体NifH。大约12种其他蛋白参与固氮细菌固氮酶的组装，包括复合物的成熟、支撑和辅助因子插入，具体为NifM、NifS、NifU、NifE、NifN、NifX、NifV、NifJ、NifY、NifF、NifZ和NifQ。遗传病变、固氮生物与非固氮原核生物之间的互补分析和系统发生分析(Dos Santos等人，2012；Temme等人，2012；Wang等人，2013)导致Nif蛋白亚组(NifD、NifK、NifB、NifE和NifN)被认为是核心组件，而其他被认为是优化活性所需的并且被认为是辅助的。固氮酶的组装和功能也需要特定的生化条件。最重要的是，固氮酶对氧极其敏感(Robson和Postgate，1980)。此外，金属蛋白酶催化中心的生物合成和功能需要大量ATP、还原剂、容易获得的Fe、Mo、S
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腺苷甲硫氨酸和高柠檬酸(Hu和Ribbe，2013；Rubo和Ludden，2008)。所有这些因素导致了在植物细胞中产生功能性固氮酶复合物的技术困难。

技术实现思路

[0005]鉴于观察到的在植物细胞中产生功能性NifD的困难，本专利技术人已经确定了表达对
植物细胞中的二次切割/降解具有抗性的NifD的重要性。
[0006]因此，一方面，本专利技术提供了一种包含编码NifD多肽(ND)的外源多核苷酸的植物细胞，该NifD多肽在对应于SEQ ID NO:18的氨基酸97
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100的氨基酸序列内的位点处对蛋白酶切割具有抗性。
[0007]在一个相关方面，本专利技术提供了一种包含编码NifD多肽(ND)的外源多核苷酸的植物细胞，该NifD多肽在对应于SEQ ID NO:18的氨基酸97
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100的位置处包含除RRNY(SEQ ID NO:101)以外的氨基酸序列。
[0008]在一个优选的实施方案中，ND在对应于SEQ ID NO:18的氨基酸97
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100的氨基酸序列内的位点处比在对应于SEQ ID NO:18的氨基酸97
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100的位置处具有氨基酸序列RRNY(SEQ ID NO:101)的相应ND对蛋白酶切割更具抗性。
[0009]在上述方面的一个实施方案中，ND包含线粒体靶向肽(MTP)，优选其中MTP位于ND的末端。
[0010]在另一个实施方案中，当外源多核苷酸在植物细胞中表达时，ND能够在MTP内或紧接MTP之后被切割以产生经加工的NifD多肽(CND)，其中CND在其N端包含来自MTP的C端氨基酸的氨基酸序列(瘢痕序列)，或者不包含瘢痕序列。
[0011]在优选的实施方案中，MTP在植物细胞中以至少50％的效率切割和/或其中CND在植物细胞中以高于ND的水平存在，优选以高于2:1、更优选高于3:1或4:1的比例存在。
[0012]在优选的实施方案中，CND具有NifD功能。
[0013]在上述方面的另一个或又一个实施方案中，外源多核苷酸编码ND，该ND是一种融合多肽(NifD
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接头
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NifK融合多肽)，其依次包含NifD氨基酸序列、接头氨基酸序列(接头)和NifK多肽(NK)氨基酸序列，其中接头氨基酸序列长度为8
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50个残基，优选约30个残基，该接头氨基酸序列翻译融合到ND和NK上。在一个优选的实施方案中，ND还包含线粒体靶向肽(MTP)，其中MTP翻译融合于NifD氨基酸序列的N端。在一个最优选的实施方案中，当外源多核苷酸在植物细胞中表达时，ND能够在MTP中或紧接MTP之后被切割以产生经加工的NifD多肽(CND)，其中CND在其N端包含瘢痕序列，或者不包含瘢痕序列。
[0014]在上述方面的一个实施方案中，ND或CND具有NifD功能，或者ND(NifD
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接头
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NifK多肽)同时具有NifD和NifK功能。在一个实施方案中，NifD多肽为AnfD多肽，NifK多肽为AnfK多肽。
[0015]在上述方面的一个实施方案中，MTP包含本文所公开的任何MTP，例如，MTP包含长度为约51个氨基酸的F1
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ATPaseγ
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亚基MTP。
[0016]在一个实施方案中，CND包含翻译融合于NifD氨基酸序列的N端的瘢痕序列，其长度为1
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45个氨基酸，优选为1
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20个氨基酸，更优选为1
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10或11
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20个氨基酸。
[0017]在另一个或又一个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种植物细胞，包含线粒体和编码至少8种或至少9种Nif融合多肽的外源多核苷，其中所述外源多核苷酸各自包含与编码所述Nif融合多肽之一的核苷酸序列可操作地连接并在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，其中每种Nif融合多肽独立地包含线粒体靶向肽(MTP)，其中所述Nif融合多肽包含(i)NifH、NifB、NifF、NifJ、NifS、NifU和NifV融合多肽，以及(ii)NifD融合多肽和NifK融合多肽或者(iii)包含具有C端的NifD序列的NifD
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接头
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NifK融合多肽、寡肽接头和具有N端的NifK序列，其中所述寡肽接头翻译融合于所述NifD序列的C端和所述NifK序列的N端，其中至少所述NifH、NifF、NifS和NifU融合多肽的线粒体加工蛋白酶(MPP)切割产物各自至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，其中(ii)的NifD和NifK融合多肽的MPP切割产物(如果存在于植物细胞中)至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，或(iii)的NifD
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接头
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NifK融合多肽的MPP切割产物(如果存在于植物细胞中)至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，并且其中NifV融合多肽和/或其MPP切割产物在植物细胞中产生高柠檬酸盐，并且至少部分可溶于植物细胞的线粒体中。2.一种植物细胞，其包含线粒体和编码至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种Nif融合多肽的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸各自包含与编码Nif融合多肽之一的核苷酸序列可操作地连接并在所述植物细胞中表达核苷酸序列的启动子，其中每种Nif融合多肽独立地包含线粒体靶向肽(MTP)，其中所述Nif融合多肽包含(i)NifW、NifX、NifY和NifZ融合多肽中的一种或多种或全部，以及(ii)NifD融合多肽和NifK融合多肽或者(iii)包含具有C端的NifD序列的NifD
‑
接头
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NifK融合多肽、寡肽接头和具有N端的NifK序列，其中所述寡肽接头翻译融合于所述NifD序列的C端和所述NifK序列的N端，其中至少所述NifW、NifX、NifY和NifZ融合多肽的线粒体加工蛋白酶(MPP)切割产物(如果存在于植物细胞中)各自至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，其中(ii)的所述NifD和NifK融合多肽的MPP切割产物(如果存在于植物细胞中)至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，或(iii)的所述NifD
‑
接头
‑
NifK融合多肽的MPP切割产物(如果存在于植物细胞中)至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，并且其中ii)的所述NifD融合多肽和NifK融合多肽的MPP切割产物或iii)的所述NifD
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接头
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NifK融合多肽的MPP切割产物在所述植物细胞中的存在量大于缺少编码(i)的所述NifW、NifX、NifY和NifZ融合多肽中的一种或多种或全部的所述外源多核苷酸的相应植物细胞中存在的所述NifD融合多肽和NifK融合多肽的MPP切割产物或所述NifD
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接头
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NifK融合多肽的MPP切割产物的量。3.一种植物细胞，其包含线粒体和编码至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种Nif融合多肽的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸各自包含与编码Nif融合多肽之一的核苷酸序列可操作地连接并在所述植物细胞中表达核苷酸序列的启动子，其中每种Nif融合多肽独立地包含线粒体靶向肽(MTP)，其中所述Nif融合多肽包含(i)NifH、NifS和NifU融合多肽和任选的NifM多肽，(ii)NifW、NifX、NifY和NifZ融合多肽中的一种或多种或全部，以及(iii)NifD融合多肽和NifK融合多肽或(iv)包含具有C端的NifD序列的NifD
‑
接头
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NifK融合多肽、寡肽接头和具有N端的NifK序列，其中所述寡肽接头翻译融合于所述NifD序列的C端和所述NifK序列的N端，其中所述NifS和NifU融合多肽的线粒体加工蛋白酶(MPP)切割产物至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，其中所述NifW、NifX、NifY和NifZ融合多肽的MPP切割产物(如果存在于植物细胞中)至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，其中(iii)的所述NifD和NifK融合多肽的MPP切割产物(如果存在于植物细胞中)至少部分可溶于植物
细胞的线粒体中，其中(iv)的所述NifD
‑
接头
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NifK融合多肽的MPP切割产物(如果存在于植物细胞中)至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，并且其中iii)的所述NifD融合多肽和NifK融合多肽的MPP切割产物或iv)的所述NifD
‑
接头
‑
NifK融合多肽的MPP切割产物作为与P簇的复合物存在于所述植物细胞中。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞包含NifH融合多肽，所述NifH融合多肽为AnfH融合多肽，其中所述NifD融合多肽(如果存在)则是AnfD融合多肽，所述NifK融合多肽(如果存在)则是AnfK融合多肽，所述NifD
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接头
‑
NifK融合多肽(如果存在)则是AnfD
‑
接头
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AnfK融合多肽，且所述植物细胞还包含编码包含MTP的AnfG融合多肽的外源多核苷酸，其中编码所述AnfG融合多肽的所述外源多核苷酸包含与编码所述AnfG融合多肽的核苷酸序列可操作地连接且在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，并且其中所述AnfG融合多肽的MPP切割产物至少部分可溶于所述植物细胞的线粒体中。5.一种植物细胞，其包含线粒体和编码至少2种、至少3种或至少4种Anf融合多肽的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸各自包含与编码Anf融合多肽之一的核苷酸序列可操作连接并在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，其中每种Anf融合多肽独立地包含线粒体靶向肽(MTP)，其中所述Anf融合多肽包含(i)AnfG融合多肽或AnfG和AnfH融合多肽，以及(ii)AnfD融合多肽和AnfK融合多肽或(iii)AnfD
‑
接头
‑
AnfK融合多肽，所述AnfD
‑
接头
‑
AnfK融合多肽包含具有C端的AnfD序列、寡肽接头和具有N端的AnfK序列，其中所述寡肽接头翻译融合于所述AnfD序列的C端和所述AnfK序列的N端，其中至少所述AnfG和AnfH融合多肽的线粒体加工蛋白酶(MPP)切割产物(如果存在于所述植物细胞中)各自至少部分可溶于所述植物细胞的线粒体中，其中(ii)的所述AnfD和AnfK融合多肽的MPP切割产物(如果存在于所述植物细胞中)至少部分可溶于所述植物细胞的线粒体中，或者(iii)的AnfD
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接头
‑
AnfK融合多肽的MPP切割产物(如果存在于所述植物细胞中)至少部分可溶于所述植物细胞的线粒体中，并且其中ii)的所述AnfD融合多肽和AnfK融合多肽的MPP切割产物或iii)的AnfD
‑
接头
‑
AnfK融合多肽的MPP切割产物(如果存在于所述植物细胞中)则在所述植物细胞中与AnfG融合多肽的MPP切割产物形成蛋白质复合物。6.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的植物细胞，其中所述NifD融合多肽或所述NifD
‑
接头
‑
NifK融合多肽存在于所述植物细胞中，并且(a)在对应于SEQ ID NO:18的氨基酸97
‑
100的氨基酸序列内的位点处对蛋白酶切割具有抗性和/或(b)在对应于SEQ ID NO:18的氨基酸97
‑
100的位置处包含除RRNY(SEQ ID NO:101)以外的氨基酸序列。7.一种植物细胞，其包含线粒体和编码NifV多肽(NV)的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸包含与编码所述NV的核苷酸序列可操作地连接并且在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，其中所述NV在所述植物细胞中产生高柠檬酸盐并且至少部分可溶于所述植物细胞的线粒体中，其中所述外源多核苷酸优选整合到所述植物细胞的核基因组中和/或在所述植物细胞的细胞核中表达，并且任选地其中所述NV包含线粒体靶向肽(MTP)。8.一种植物细胞，其包含编码NifD多肽(ND)的外源多核苷酸，所述ND(a)在对应于SEQ ID NO：18的氨基酸97
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100的氨基酸序列内的位点处对蛋白酶切割具有抗性和/或(b)在对应于SEQ ID NO：18的氨基酸97
‑
100的位置处包含除RRNY(SEQ ID NO：101)以外的氨基酸序列，其中所述外源多核苷酸包含与编码所述ND的核苷酸序列可操作连接并在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，并且其中所述NifD多肽优选包含MTP。
9.根据权利要求8所述的植物细胞，其包含编码NifK多肽(NK)的外源多核苷酸，其中编码所述NK的所述外源多核苷酸包含与编码所述NK的核苷酸序列可操作地连接并且在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，其中所述ND具有C端并且所述NK具有N端，并且其中(i)所述NK包含线粒体靶向肽(MTP)或者(ii)所述ND和NK翻译融合为包含寡肽接头的NifD
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接头
‑
NifK融合多肽，其中所述寡肽接头翻译融合于所述ND的C端和所述NK的N端。10.根据权利要求8或权利要求9所述的植物细胞，其还包含编码NifH融合多肽(NH)的外源多核苷酸，其中编码所述NH的所述外源多核苷酸包含与编码所述NH的核苷酸序列可操作地连接并在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，其中所述NH包含线粒体靶向肽(MTP)，并且优选其中所述NH和/或其MPP切割产物至少部分可溶于植物细胞的线粒体中。11.根据权利要求8
‑
10中任一项所述的植物细胞，其中所述多肽中的至少一种或多种的MPP切割产物至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，优选其中NifD、NifK和NifD
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接头
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NifK融合多肽中每一种的MPP切割产物(如果存在于植物细胞中)，并且所述NifH多肽至少部分可溶于植物细胞的线粒体中。12.一种植物细胞，其包含编码NifH融合多肽(NH)的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸包含与编码所述NH的核苷酸序列可操作地连接并在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，其中所述NH包含线粒体靶向肽(MTP)，其中所述NH的MPP切割产物至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，以及任选地其中所述外源多核苷酸被整合到所述植物细胞的核基因组中和/或在所述植物细胞的细胞核中表达。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的植物细胞，其还包含编码NifM多肽(NM)的外源多核苷酸，其中编码所述NM的所述外源多核苷酸包含与编码所述NM的核苷酸序列可操作地连接并在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，并且其中所述NM任选地包含线粒体靶向肽(MTP)。14.根据权利要求2或4
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13中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码NifS和NifU融合多肽的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸各自包含与编码所述Nif融合多肽之一的核苷酸序列可操作地连接并在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，并且其中所述NifS和NifU融合多肽各自包含线粒体靶向肽(MTP)。15.根据权利要求7
‑
11或权利要求13或14中任一项所述的植物细胞，其中各Nif多肽作为包含线粒体靶向肽(MTP)的Nif融合多肽在所述植物细胞中产生，其中各MTP独立地相同或不同，优选其中所述MTP位于至少一种或多种或全部Nif融合多肽的N端。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的植物细胞，其中在所述植物细胞中产生的各Nif融合多肽(i)在所述MTP序列内被MPP独立切割以产生MPP切割的Nif多肽，其中所述MPP切割的Nif多肽在其N端包含来自所述MTP的C端肽(瘢痕肽)，或者(ii)紧接MTP之后被MPP独立切割，其中所述MPP切割的Nif多肽不包含来自所述MTP的C端肽。17.根据权利要求15或16所述的植物细胞，其中各MTP在所述植物细胞中以至少50％的效率独立切割和/或其中各切割的Nif多肽以高于相应未切割的Nif融合多肽的水平独立存在于所述植物细胞中，优选以高于1:1、2:1或3:1的比例存在。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的植物细胞，其中各Nif融合多肽在所述植物细胞中在其MTP序列中被至少部分切割以产生MPP切割的Nif多肽，其中各MPP切割的Nif多肽独立地包含衍生自所述MTP序列的长度为1
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45个氨基酸、优选地长度为1
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20个氨基酸、更优选
地长度为1
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11或11
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20个氨基酸的肽(瘢痕肽)，其翻译融合于所述MPP切割的Nif多肽的N端。19.根据权利要求1
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18中任一项所述的植物细胞，其还包含编码铁氧化还原蛋白融合多肽、优选FdxN融合多肽的外源多核苷酸，其中编码所述铁氧化还原蛋白(ferredoxin)融合多肽的所述外源多核苷酸包含与编码所述铁氧化还原蛋白融合多肽的核苷酸序列可操作地连接并在所述植物细胞中表达所述核苷酸序列的启动子，并且其中所述铁氧化还原蛋白融合多肽包含线粒体靶向肽(MTP)。20.根据权利要求19所述的植物细胞，其中所述铁氧还蛋白融合多肽的MPP切割产物至少部分可溶于植物细胞的线粒体中，并且优选地，其中所述外源多核苷酸被整合到所述植物细胞的核基因组中和/或在所述植物细胞的细胞核中表达。21.根据权利要求1
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20中任一项所述的植物细胞，其包含NifD
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接头
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NifK融合多肽，所述融合多肽依次包含NifD氨基酸序列(ND)、寡肽接头和NifK多肽(NK)氨基酸序列，其中所述寡肽接头的长度为8
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50个残基、优选地长度为16
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50个残基、更优选地长度为约26或约30个残基、或最优选地长度为30个残基，所述接头氨基酸序列翻译融合于所述ND和NK。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的植物细胞，其中各Nif融合多肽在所述植物细胞中被切割以产生作为功能性Nif多肽的Nif多肽。23.根据权利要求1
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7或12
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22中任一项所述的植物细胞，其包含编码NifD融合多肽(ND)或NifD
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接头
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NifK融合多肽的外源多核苷酸，其中所述ND或NifD
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接头
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NifK融合多肽在对应于SEQ ID NO:18的氨基酸97
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100的位置处包含除RRNY(SEQ ID NO:101)以外的氨基酸序列，并且其中所述ND或NifD
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接头
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NifK融合多肽优选在对应于SEQ ID NO:18的氨基酸100的位置处包含除酪氨酸(Y)以外的氨基酸。24.根据权利要求23所述的植物细胞，其中所述ND或NifD
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接头
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NifK融合多肽在对应于SEQ ID NO:18的氨基酸100的位置处包含谷氨酰胺(Q)或赖氨酸(K)，或在对应于SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：联邦科学技术研究组织，
类型：发明
国别省市：