一种磷酸三酯酶的超高通量筛选方法技术

本发明专利技术属于酶工程领域，公开了一种基于羧基香豆素的磷酸三酯酶荧光底物，以及基于该底物的磷酸三酯酶的高通量筛选方法。该方法为磷酸三酯酶的体外区室化-荧光激活细胞分选超高通量筛选技术。本发明专利技术基于羧基香豆素的磷酸三酯酶底物，反应后的荧光产物具有非常好的液滴保留性，在进行酶活性定量与筛选中具有灵敏度高、定量准确的优点。底物和反应产物之间亲水性的差异，使底物可以加入外水相中并通透油相进行酶反应；生成的产物由于亲水性提高而保留在液滴中，从而实现“液滴荧光捕获”的效应，准确地控制反应时间、降低荧光背景干扰、提高筛选准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种磷酸三酯酶的超高通量筛选方法
本专利技术属于酶工程领域，涉及一种针对磷酸三酯酶的超高通量筛选方法，具体地说涉及一种磷酸三酯酶荧光底物的设计合成，以及基于该底物的针对磷酸三酯酶的体外区室化-荧光激活细胞分选(invitrocompartmentalizationbasedfluorescence-activatedcellsorting，IVC-FACS)超高通量筛选技术。
技术介绍
磷酸三酯酶(EC3.1.8.1)是降解有机磷化合物的有效生物催化剂，在有机磷农药、有机磷化学战剂的检测、降解和解毒方面有着重要的应用(Afriat-Jurnou,L.；Roodveldt,C.；Manco,G.；Tawfik,D.S.Biochemistry2006,45,13677–13686.Afriat-Jurnou,L.；Jackson,C.J.；Tawfik,D.S.Biochemistry2012,51,6047–6055)。同时，磷酸三酯酶还是一类研究蛋白质自然进化机理的重要模式酶(Tokuriki,N.；Tawfik,D.S.Nature2009,459,668–673.Gupta,R.D.；Tawfik,D.S.Nat.Methods2008,5,939–942.)，由于自然界中的磷酸三酯酶是近几十年来伴随着有机磷农药的出现才迅速进化出来的，因此被公认为是自然界中对非天然底物催化活性进化最快的酶之一，研究该类酶的进化模式，有助于人类更好地了解自然界定向进化的机制。近年来，研究者对磷酸三酯酶进行了大量的定向进化研究(Zhang,Y.；An,J.；Ye,W.；Yang,G.；Qian,Z.G.；Chen,H.F.；Cui,L.；Feng,Y.Appl.Environ.Microbiol.2012,78,6647–6655.Meier,M.M.；Rajendran,C.；Malisi,C.；Fox,N.G.；Xu,C.；Schlee,S.；Barondeau,D.P.；B.；Sterner,R.；Raushel,F.M.J.Am.Chem.Soc.2013,135,11670–11677.Mandrich,L.；Merone,L.；Manco,G.Environ.Technol.2010,31,1115–1127.Draganov,D.I.Chem.Biol.Interact.2010,187,370–372.)，以期获得催化性质优良的突变酶，并揭示该类酶进化的分子机制。对磷酸三酯酶进行定向进化研究，需要从大量的突变体中筛选出极少数性质提高的突变体，因此要求对突变库进行快速高效的筛选。而常规的基于底物平板或微孔板的筛选方法由于筛选通量低(<105/天)、费时费力而很难满足对酶进行快速定向进化的要求。区室化-荧光激活细胞分选(invitrocompartmentalizationbasedfluorescence-activatedcellsorting，IVC-FACS)是新近出现的酶活性超高通量筛选技术(Aharoni,A.；Amitai,G.；Bernath,K.；Magdassi,S.；Tawfik,D.S.Chem.Biol.2005,12,1281-1289.Mastrobattista,E.；TalyV.；Chanudet,E.；Treacy,P.；Kelly,B.T.；Griffiths,A.D.Chem.Biol.200512,1291-1300.)，该技术利用“水包油包水”二级微液滴作为酶反应体系，在皮升级的体积中包裹酶、基因、底物及荧光产物，利用流式细胞仪可以根据微液滴的荧光强度而对其中的酶活性进行定量，并快速分选出符合预期性质的突变体，其筛选通量高达108个液滴/天，同时大大降低了筛选的试剂和人力消耗，因此被称为超高通量筛选体系。IVC-FACS技术的关键在于获得适于微液滴实验的底物，该底物经酶催化后的荧光产物必须能够在微液滴中有很好的保留才能够准确反映其中的酶活性。目前，只有Tawfik等人开发的一种基于3-氰基-7-羟基香豆素的底物应用磷酸三酯酶的IVC-FACS筛选(Gupta,R.D.；Goldsmith,M.；Ashani,Y.；Simo,Y.；Mullokandov,G.；Bar,H.；Ben-David,M.；Leader,H.；Margalit,R.；Silman,I.；Sussman,J.L.；Tawfik,D.S.Nat.Chem.Biol.2011,7,120-125)，但该底物的产物3-氰基-7-羟基香豆素在微液滴中仍然扩散很快，使得筛选方法的灵敏度和准确度都受到了极大的影响。这里，我们通过对香豆素进行极性修饰，获得了基于羧基香豆素的磷酸三酯酶底物，其酶反应产物具有良好的液滴保留性能，基于该底物的IVC-FACS体系能够快速准确地对磷酸三酯酶进行活性定量和筛选，在磷酸三酯酶定向进化领域有着重要应用潜力。现有的基于氰基香豆素磷酸三酯酶底物DEPCyC的IVC-FACS体系由于反应产物氰基香豆素(图1，3-cyano-7-hydroxycoumarin，CYHC)疏水性较强，容易快速通过“水包油包水”二级微液滴的油相进入外水相，造成荧光信号快速扩散出微液滴，因而无法准确反映酶活性，进而影响筛选的准确度和效率。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种新型的磷酸三酯酶底物，可用于筛选和富集磷酸三酯酶，磷酸三酯酶突变体或者含有磷酸三酯酶突变体的工程菌。本专利技术还提供了上述磷酸三酯酶底物的制备方法。本专利技术还提供了利用上述磷酸三酯酶底物的磷酸三酯酶高通量筛选方法。这种磷酸三酯酶底物是7-羟基香豆素-3-酸-磷酸二烷酯，结构如式(I)所示：其中R1选自C1～C6烷基；A为羧基、羧甲基、羧乙基、羧丙基或羧丁基。优选的，R1为甲基、乙基、丙基或丁基。所述磷酸三酯酶荧光底物选自：7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二乙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二甲酯、7-羟基香豆素-3羧酸-磷酸二丙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二丁酯、7-羟基香豆素-3-羧甲酸-磷酸二乙酯、7-羟基香豆素-3-羧甲酸-磷酸二甲酯、7-羟基香豆素-3羧甲酸-磷酸二丙酯、7-羟基香豆素-3-羧甲酸-磷酸二丁酯、7-羟基香豆素-3-羧乙酸-磷酸二乙酯、7-羟基香豆素-3-羧乙酸、7-羟基香豆素-3羧乙酸--磷酸二丙酯、7-羟基香豆素-3-羧乙酸-磷酸二丁酯。上述磷酸三酯酶荧光底物可应用于筛选和富集磷酸三酯酶突变体或者含有磷酸三酯酶突变体的工程菌。磷酸三酯酶荧光底物的制备方法，步骤为:(1)将式(II)的7-羟基豆香素-3-酸类化合物及1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯溶解于DMF中，加入苄基溴，搅拌反应10～16小时；(2)向反应体系中加水过滤，取沉淀干燥后溶解于四氯化碳与四氢呋喃的混合液中；0～4℃下加入三乙胺，再加入式(III)的磷酸二烷酯，搅拌反应2～6小时；(3)用水和二氯甲烷萃取，分离有机相蒸发浓缩，残留液体经硅胶柱层析，溶解于乙酸乙酯；溶液中加入Pd/C催化剂并加氢还原；过滤取沉淀重结晶。磷酸二甲酯、磷酸二丙酯、磷酸二丁酯代替磷酸二乙酯，或者用7-羟基香豆素-3-羧甲酸、7-羟基香豆素-3-羧乙酸、7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磷酸三酯酶荧光底物，其特征在于，结构如式(I)所示，其中R1选自C1～C6烷基；A为羧基、羧甲基、羧乙基、羧丙基、羧丁基。

【技术特征摘要】
1.一种磷酸三酯酶荧光底物，其特征在于，结构如式(I)所示，其中R1选自C1～C6烷基；A为羧基。2.权利要求1所述磷酸三酯酶荧光底物，其特征在于，R1为甲基、乙基、丙基或丁基。3.权利要求1所述磷酸三酯酶荧光底物，其特征在于，所述的磷酸三酯酶荧光底物选自：7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二乙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二甲酯、7-羟基香豆素-3羧酸-磷酸二丙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸-磷酸二丁酯。4.权利要求1～3任一项所述磷酸三酯酶荧光底物在筛选和富集磷酸三酯酶突变体或者含有磷酸三酯酶突变体的工程菌方面的应用。5.权利要求1～3所述磷酸三酯酶荧光底物的制备方法，其特征在于，步骤为，(1)将式(II)的7-羟基香豆素-3-酸类化合物及1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯溶解于DMF中，加入苄基溴，搅拌反应10～16小时；(2)向反应体系中加水过滤，取沉淀干燥后溶解于四氯化碳与四氢呋喃的混合液中；0～4℃下加入三乙胺，再加入式(III)的磷酸二烷酯，搅拌反应2～6小时；R1选自C1～C6烷基；A为羧基；(3)用水和二氯甲烷萃取，分离有机相蒸发浓缩，残留液体经硅胶柱层析，溶解于乙酸乙酯；溶液中加入Pd/C催化剂并加氢还原；过滤取沉淀重结晶。6.一种磷酸三酯酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨广宇，马富强，冯雁，韩云宾，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31