调节植物开花的RNA分子制造技术

本发明专利技术涉及新的双链RNA(dsRNA)结构及其在调节植物开花中的用途。本发明专利技术还涉及调节植物开花时间的方法。物开花时间的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】调节植物开花的RNA分子
专利

[0001]本专利技术涉及新的双链RNA(dsRNA)结构及其在调节植物开花中的用途。本专利技术还涉及调节植物开花时间的方法。
[0002]专利技术背景
[0003]RNA沉默是真核生物中进化保守的基因沉默机制，其由双链RNA(dsRNA)诱导，所述双链RNA可以是称为发夹结构RNA(hpRNA)的形式。在基本的RNA沉默途径中，dsRNA被Dicer蛋白质加工成短的20
‑
25个核苷酸(nt)的小RNA双链体，其中一条链与Argonaute(AGO)蛋白质结合形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。该沉默复合体使用小RNA作为向导来寻找并结合互补的单链RNA，其中AGO蛋白质切割RNA导致其降解。
[0004]在植物中，存在多种RNA沉默途径，包括microRNA(miRNA)、反式作用小干扰RNA(tasiRNA)、重复相关siRNA(rasiRNA)和外源(病毒和转基因)siRNA(exosiRNA)途径。miRNA是从短茎环前体RNA由Dicer
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like 1(DCL1)在细胞核中加工的20
‑
24nt的小RNA，所述短茎环前体RNA从MIR基因由RNA聚合酶II转录。tasiRNA是主要大小为21nt的阶段性siRNA，其衍生自长dsRNA的DCL4加工，所述长dsRNA是由RNA依赖性RNA聚合酶6(RDR6)从miRNA切割的TAS RNA片段合成的。24
‑
nt rasiRNA由DCL3加工，且前体dsRNA由植物特异性DNA
‑
依赖性RNA聚合酶IV(PolIV)和RDR2的组合功能从基因组中的重复DNA生成。exosiRNA途径与tasiRNA和rasiRNA途径重叠，并且DCL4和DCL3都参与exosiRNA加工。除了DCL1、DCL3和DCL4外，模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和其他高等植物编码DCL2或等价物，其生成22
‑
nt siRNA，包括22
‑
nt exosiRNA，并在植物中系统性和瞬时性基因沉默中发挥关键作用。所有这些植物小RNA均通过HUA增强子1(HEN1)在3
’
端核苷酸的2'
‑
羟基处甲基化，并且认为该3
’
端2'
‑
O
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甲基化稳定植物细胞中的小RNA。miRNA、tasiRNA和exosiRNA在功能上类似于动物细胞中的小RNA，其参与动物中转录后基因沉默或RNA的序列特异性降解。但是，rasiRNA对植物而言是独特的，并具有在同类DNA上引导从头(de novo)胞嘧啶甲基化的功能，这种转录基因沉默机制被称为RNA引导的DNA甲基化(RdDM)。
[0005]dsRNA诱导的RNA沉默已被广泛利用以减少各种真核系统中的基因活性，并且已经开发了许多基因沉默技术。不同的生物体通常适合于不同的基因沉默方法。例如，由于dsRNA诱导的干扰素应答，长dsRNA(长度至少100个碱基对)不太适合在哺乳动物细胞中诱导RNA沉默，且因此哺乳动物细胞中通常使用较短的dsRNA(少于30个碱基对)，而在植物中，具有长dsRNA茎的发夹RNA(hpRNA)非常有效。在植物中，不同的RNA沉默途径导致了不同的基因沉默技术，例如人工miRNA、人工tasiRNA和病毒诱导的基因沉默技术。然而，迄今为止，RNA沉默技术在植物中的成功应用主要是通过使用长的hpRNA转基因实现的。hpRNA转基因构建体通常包括反向重复，所述反向重复包括由间隔区序列(形成hpRNA的环)隔开的靶基因序列的完全互补的有义和反义序列(当从hpRNA的dsRNA茎转录时)，其插入用于在植物细胞中表达的启动子和转录终止子之间。间隔区序列的功能是在构建体制备过程中稳定细菌中的反向重复DNA。产生的hpRNA转录物的dsRNA茎被DCL蛋白质加工成引导靶基因沉默的siRNA。hpRNA转基因已被广泛用于敲低基因表达、修饰代谢途径并增强植物的疾病和害虫
抗性以改良作物，且现已报道该技术在作物改良中的许多成功应用(Guo等，2016；Kim等，2019)。
[0006]但是，最近的研究表明，hpRNA转基因会遭受自我诱导的转录抑制，从而损害了靶基因沉默的稳定性和功效。尽管所有转基因都可能遭受位置或拷贝数依赖性转录沉默的影响，但是hpRNA转基因是独特的，因为他们生成siRNA，siRNA可通过RdDM途径将DNA甲基化引导至其自身序列，并且有可能导致转录自我沉默。
[0007]虽然dsRNA诱导的基因沉默已被证明是改变生物体表型的有价值工具，但需要可用于RNAi的可选的、优选改善的dsRNA分子。
[0008]专利技术概述
[0009]本专利技术人构思了用于产生RNA分子的遗传构建体的新设计，其包括一个或多个双链RNA区域，所述双链RNA区域包含多个非规范碱基配对的核苷酸或非碱基配对的核苷酸，或两者，包括具有两个或多个环序列的形式，在本文中称为环端dsRNA(ledRNA)。这些RNA分子具有以下一种或多种特征：他们易于合成，在编码他们的遗传构建体转录后在植物细胞中积累到更高的水平，他们更容易形成dsRNA结构并诱导植物细胞中靶RNA分子有效沉默，并且在植物细胞中加工后可以形成环状RNA分子。
[0010]本专利技术人还确定了调节植物开花时间的基因的活性可以通过在较早时间例如产生植物的种子时使用内源或优选外源应用于植物细胞的RNA分子来调节。所述RNA分子可以减少或消除涉及开花时间的一种或多种基因的功能，例如开花抑制因子，从而促进开花。因此，本公开还提供了一种影响植物的开花时间的方法。这可用于降低或抑制具有通过靶向其RNA转录物降低基因表达来影响开花特征的能力的基因的活性。例如，这种调节可用于促进杂交种子生产中雄性和雌性亲本系的同步开花。另一种用途是根据天气的变化提前或延缓开花，或延长或缩短生长季节。由于在植物的至少一些细胞内表达不足，因此所述植物基因的活性优选被降低。
[0011]植物经典育种和栽培的一个目标是选择具有确定开花时间的品种。早开花品种使得在植物物种通常不会完全成熟的地区种植重要作物成为可能。晚开花品种可以增加或改善植物部分(例如叶、茎和块茎)的产量。使用本专利技术的RNA分子有利地促进了上一代晚开花品种的种子生产。然而，通过经典育种选择早开花或晚花品种是一个非常耗时的过程。本公开的RNA分子和方法在这方面是有利的。
[0012]在第一方面，本专利技术提供了一种RNA分子，其包含第一RNA组分、与第一RNA组分共价连接的第二RNA组分，以及任选地包含以下的一种或多种或全部：(i)与第一和第二RNA组分共价连接的连接核糖核苷酸序列，(ii)5'前导序列和(iii)3'尾随序列，
[0013]其中所述第一RNA组分按5'至3'顺序由第一5'核糖核苷酸、第一RNA序列和第一3
’
核糖核苷酸组成，其中所述第一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种RNA分子，其包含第一RNA组分、与第一RNA组分共价连接的第二RNA组分，以及任选地包含以下一种或多种或全部：(i)与所述第一RNA组分和第二RNA组分共价连接的连接核糖核苷酸序列，(ii)5'前导序列和(iii)3'尾随序列，其中所述第一RNA组分按5'至3'顺序由第一5'核糖核苷酸、第一RNA序列和第一3
’
核糖核苷酸组成，其中所述第一5'核糖核苷酸和第一3'核糖核苷酸在所述第一RNA组分中彼此碱基配对，其中所述第一RNA序列包含至少20个连续核糖核苷酸的第一有义核糖核苷酸序列、至少4个核糖核苷酸的第一环序列和至少20个连续核糖核苷酸的第一反义核糖核苷酸序列，其中所述第一反义核糖核苷酸序列与所述第一有义核糖核苷酸序列在所述RNA分子中杂交，其中所述第一反义核糖核苷酸序列能够与调节植物开花时间的靶RNA分子的第一区域杂交，其中，如果存在所述连接核糖核苷酸序列，则所述第二RNA组分与所述第一5'核糖核苷酸或所述第一3'核糖核苷酸通过所述连接核糖核苷酸序列共价连接，或如果不存在所述连接核糖核苷酸序列，则所述第二RNA组分与所述第一5'核糖核苷酸或所述第一3'核糖核苷酸直接地共价连接，其中所述第二RNA组分按5'至3'顺序由第二5'核糖核苷酸、第二RNA序列和第二3'核糖核苷酸组成，其中所述第二5'核糖核苷酸和第二3'核糖核苷酸在所述RNA分子中彼此碱基配对，其中所述第二RNA序列包含第二有义核糖核苷酸序列、至少4个核糖核苷酸的第二环序列和第二反义核糖核苷酸序列，其中所述第二有义核糖核苷酸序列与所述第二反义核糖核苷酸序列在所述RNA分子中杂交；其中如果存在5'前导序列，则所述5'前导序列由下述核糖核苷酸序列组成，如果所述第二RNA组分与所述第一3'核糖核苷酸连接则所述核糖核苷酸序列与所述第一5'核糖核苷酸共价连接，或者如果所述第二RNA组分与所述第一5'核糖核苷酸连接则所述核糖核苷酸序列与所述第二5'核糖核苷酸共价连接，并且其中如果存在3'尾随序列，则所述3'尾随序列由下述核糖核苷酸序列组成，如果所述第二RNA组分与所述第一3'核糖核苷酸连接则所述核糖核苷酸序列与所述第二3'核糖核苷酸共价连接，或者如果所述第二RNA组分与所述第一5'核糖核苷酸连接，则所述核糖核苷酸序列与所述第一3'核糖核苷酸共价连接。2.一种RNA分子，其包含第一RNA组分、与第一RNA组分共价连接的第二RNA组分，以及任选地包含以下一种或多种或全部：(i)与所述第一RNA组分和第二RNA组分共价连接的连接核糖核苷酸序列，(ii)5'前导序列和(iii)3'尾随序列，其中所述第一RNA组分按5'至3'顺序由第一5'核糖核苷酸、第一RNA序列和第一3'核糖核苷酸组成，其中所述第一5'核糖核苷酸和第一3'核糖核苷酸碱基配对，其中所述第一RNA序列包含第一有义核糖核苷酸序列、至少4个核糖核苷酸的第一环序列和第一反义核糖核苷酸序列，其中所述第一有义核糖核苷酸序列和第一反义核糖核苷酸序列各自由至少20个连续的核糖核苷酸组成，其中所述第一有义核糖核苷酸序列的所述至少20个连续的核糖核苷酸与所述第一反义核糖核苷酸序列的所述至少20个连续的核糖核苷酸完全碱基配对，其中所述第一有义核糖核苷酸序列的所述至少20个连续的核糖核苷酸在序列上与调节植物开花时间的靶RNA分子的第一区域相同，其中，如果存在所述连接核糖核苷酸序列，则所述第二RNA组分与所述第一5'核糖核苷
酸或所述第一3'核糖核苷酸通过所述连接核糖核苷酸序列共价连接，其中所述第二RNA组分按5'至3'顺序由第二5'核糖核苷酸、第二RNA序列和第二3'核糖核苷酸组成，其中所述第二5'核糖核苷酸和第二3'核糖核苷酸碱基配对，其中所述第二RNA序列包含第二有义核糖核苷酸序列、至少4个核糖核苷酸的第二环序列和第二反义核糖核苷酸序列，其中所述第二有义核糖核苷酸序列与所述第二反义核糖核苷酸序列碱基配对，其中如果存在所述5'前导序列，则所述5'前导序列由下述核糖核苷酸序列组成，如果所述第二RNA组分与所述第一3'核糖核苷酸连接则所述核糖核苷酸序列与所述第一5'核糖核苷酸共价连接，或者如果所述第二RNA组分与所述第一5'核糖核苷酸连接则所述核糖核苷酸序列与所述第二5'核糖核苷酸共价连接，并且其中如果存在所述3'尾随序列，则所述3'尾随序列由下述核糖核苷酸序列组成，如果所述第二RNA组分与所述第一3'核糖核苷酸连接，则所述核糖核苷酸序列与所述第二3'核糖核苷酸共价连接，或者如果所述第二RNA组分与所述第一5'核糖核苷酸连接，则所述核糖核苷酸序列与所述第一3'核糖核苷酸共价连接。3.根据权利要求1或2所述所述的RNA分子，其中所述第一反义核糖核苷酸序列的所述至少20个连续核糖核苷酸均能与所述靶RNA分子的所述第一区域的核苷酸碱基配对。4.根据权利要求1至3任一项所述的RNA分子，其中所述第一有义核糖核苷酸序列与所述第一5'核糖核苷酸共价连接而没有任何间插核苷酸，或所述第一反义核糖核苷酸序列与第一3
’
核糖核苷酸共价连接而没有任何间插核苷酸，或所述第一有义核糖核苷酸序列与所述第一5'核糖核苷酸共价连接而没有任何间插核苷酸且或所述第一反义核糖核苷酸序列与第一3
’
核糖核苷酸共价连接而没有任何间插核苷酸。5.根据权利要求1至4任一项所述的RNA分子，其包含所述连接核糖核苷酸序列，其中所述连接核糖核苷酸序列少于20个核糖核苷酸。6.根据权利要求5所述的RNA分子，其中所述连接核糖核苷酸序列与所述靶RNA分子杂交。7.根据权利要求5或6所述的RNA分子，其中所述连接核糖核苷酸序列与所述靶RNA分子的互补体的一部分相同。8.根据权利要求5至7任一项所述的RNA分子，其中所述连接核糖核苷酸序列的长度为1至50个核糖核苷酸。9.根据权利要求5至7中任一项所述的RNA分子，其中所述连接核糖核苷酸序列的长度为1至10个核糖核苷酸。10.根据权利要求1至9任一项所述的RNA分子，其包含两个或多个有义核糖核苷酸序列，以及与所述有义核糖核苷酸序列完全碱基配对的反义核糖核苷酸序列，其在序列上与靶RNA分子的区域相同。11.根据权利要求10所述的RNA分子，其中所述两个或多个有义核糖核苷酸序列在序列上与相同靶RNA分子的不同区域相同。12.根据权利要求10所述的RNA分子，其中所述两个或多个有义核糖核苷酸序列在序列上与不同靶RNA分子的区域相同。13.根据权利要求1至12任一项所述的RNA分子，其包含两个或多个反义核糖核苷酸序列，以及与所述反义核糖核苷酸序列完全碱基配对的有义核糖核苷酸序列，其均与靶RNA分
子的区域互补。14.根据权利要求13所述的RNA分子，其中所述两个或多个反义核糖核苷酸序列与相同靶RNA分子的不同区域互补。15.根据权利要求13或14所述的RNA分子，其中所述两个或多个反义核糖核苷酸序列中的第二序列与所述两个或多个反义核糖核苷酸序列中的第一序列不同的靶RNA分子的区域互补。16.根据权利要求1至15任一项所述的RNA分子，其中所述两个或多个有义核糖核苷酸序列不具有间插环序列。17.根据权利要求2至16任一项所述的RNA分子，其是单链核糖核苷酸，具有5
’
端、至少一个长度为至少21个核苷酸的有义核糖核苷酸序列、与每个有义核糖核苷酸序列在至少21个连续核苷酸上是完全碱基配对的反义核糖核苷酸序列、至少两个环序列和3
’
端。18.根据权利要求1、或3至16任一项所述的RNA分子，其是单链核糖核苷酸，具有5
’
端、至少一个长度为至少21个核苷酸的有义核糖核苷酸序列、与每个有义核糖核苷酸序列在至少21个连续核苷酸上是完全碱基配对的反义核糖核苷酸序列、至少两个环序列和3
’
端。19.根据权利要求1至18任一项所述的RNA分子，其是单链核糖核苷酸，包含5'端、第一RNA组分、第二RNA组分和3'端，所述第一RNA组分包含长度为至少21个核苷酸的第一有义核糖核苷酸序列、至少一个环序列、与第一有义核糖核苷酸序列在至少21个连续核苷酸长度上杂交的第一反义核糖核苷酸序列，所述第二RNA组分包含长度为至少21个核苷酸的第二有义核糖核苷酸序列、环序列、与第二有义核糖核苷酸序列在至少21个连续核苷酸长度上杂交的第二反义核糖核苷酸序列，其中所述RNA分子仅具有一个5'端和一个3'端。20.根据权利要求19所述的RNA分子，其中在所述5'端的所述核糖核苷酸与在所述3'端的所述核糖核苷酸相邻，每个碱基均配对并且不直接共价键合。21.根据权利要求1至20任一项所述的RNA分子，其包含与靶RNA的第一区域杂交的第一反义核糖核苷酸序列、与靶RNA的第二区域杂交的第二反义核糖核苷酸序列、所述靶RNA的第二区域与所述靶RNA的第一区域不同，并且所述RNA分子仅包含与所述靶RNA杂交的一个有义核糖核苷酸序列，其中所述两个反义序列在所述RNA分子中是不连续的。22.根据权利要求1至20任一项所述的RNA分子，其包含与靶RNA的第一区域至少60％相同的第一有义核糖核苷酸序列、与靶RNA的第二区域至少60％相同的第二有义核糖核苷酸序列，所述靶RNA的第二区域与所述靶RNA的第一区域不同，并且所述RNA分子仅包含与靶RNA杂交的一个反义核糖核苷酸序列，其中所述两个有义序列在所述RNA分子中是不连续的。23.根据权利要求1至22任一项所述的RNA分子，其具有所述5
’
前导序列。24.根据权利要求1至23任一项所述的RNA分子，其具有所述3
’
尾随序列。25.根据权利要求1至24任一项所述的RNA分子，其中每个核糖核苷酸与两个其他核苷酸共价连接。26.权利要求25所述的RNA分子，其中至少一个或所有所述环序列长于20个核苷酸。27.根据权利要求1至15任一项所述的RNA分子，其中所述RNA分子不具有、或具有一个、或两个或多个隆起，或者所述RNA分子的双链区域包含一个、或两个或多个在所述双链区域没有碱基配对的核苷酸。
28.根据权利要求1至27任一项所述的RNA分子，其具有三个、四个或多个环。29.根据权利要求1至27任一项所述的RNA分子，其仅具有两个环。30.根据权利要求1至29任一项所述的RNA分子，其中所述靶RNA在植物细胞中。31.根据权利要求30所述的RNA分子，其中所述植物细胞来自拟南芥(Arabidopsis)、玉米、加拿大油菜(canola)、棉花、大豆、苜蓿、莴苣、小麦、大麦、水稻、豆科植物、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)、甜菜或黑麦。32.根据权利要求30或31所述的RNA分子，其存在于植物细胞中。33.根据权利要求32所述的RNA分子，其在所述细胞中表达。34.根据权利要求1至33任一项所述的RNA分子，其中至少一个所述环中的长度为4至1,000个核糖核苷酸，或4至200个核糖核苷酸。35.根据权利要求34所述的RNA分子，其中所有所述环的长度为4至1,000个核糖核苷酸之间，或4至200个核糖核苷酸。36.根据权利要求35所述的RNA分子，其中所有所述环的长度为4至50个核糖核苷酸。37.根据权利要求1至36任一项所述的RNA分子，其中每个环的长度为20至30个核糖核苷酸。38.根据权利要求1至37任一项所述的RNA分子，其中所述靶RNA编码蛋白质。39.根据权利要求1至38任一项所述的RNA分子，其包含SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147所示的核苷酸序列。40.一种嵌合核糖核酸(RNA)分子，其包含双链RNA(dsRNA)区域，所述双链RNA(dsRNA)区域包含长度为至少20个连续核苷酸的第一有义核糖核苷酸序列和长度为至少20个连续核苷酸的第一反义核糖核苷酸序列，由此所述第一有义核糖核苷酸序列和所述第一反义核糖核苷酸序列能够彼此杂交以形成所述dsRNA区域，其中i)所述第一有义核糖核苷酸序列由按5
’
至3
’
顺序共价连接的第一5
’
核糖核苷酸、第一RNA序列和第一3
’
核糖核苷酸组成，ii)所述第一反义核糖核苷酸序列由按5
’
至3
’
顺序共价连接的第二5
’
核糖核苷酸、第二RNA序列和第二3
’
核糖核苷酸组成，iii)所述第一5
’
核糖核苷酸与所述第二3
’
核糖核苷酸碱基配对以形成所述dsRNA区域的端碱基对，iv)所述第二5
’
核糖核苷酸与所述第一3
’
核糖核苷酸碱基配对以形成所述dsRNA区域的端碱基对，v)所述第一有义核糖核苷酸序列和所述第一反义核糖核苷酸序列的总计约5％至约40％的所述核糖核苷酸以非规范碱基对碱基配对或未碱基配对，vi)所述dsRNA区域不包含20个连续的规范碱基对，vii)所述RNA分子能够在植物细胞中或体外被加工，由此切割所述第一反义核糖核苷酸序列，以产生长度为20
‑
24个核糖核苷酸的短反义RNA(asRNA)分子，viii)所述RNA分子或至少一些所述asRNA分子或两者能够降低调节植物开花时间的靶RNA分子的表达或活性，以及ix)所述RNA分子能够通过在体外或在细胞中或在两者中转录进行酶促制备。41.权利要求40所述的嵌合RNA分子，其中所述第一有义核糖核苷酸序列通过第一连接
核糖核苷酸序列与所述第一反义核糖核苷酸序列共价连接，所述第一连接核糖核苷酸序列包含长度为至少4个核苷酸、或4至1000个核糖核苷酸、或4至200个核糖核苷酸、或4至50个核糖核苷酸、或至少10个核苷酸、或10至1000个核糖核苷酸、或10至200个核糖核苷酸、或10至50个核糖核苷酸的环序列，由此所述第一连接核糖核苷酸序列与所述第二3
’
核糖核苷酸和所述第一5
’
核糖核苷酸共价连接，或优选地与所述第一3
’
核糖核苷酸和所述第二5
’
核糖核苷酸共价连接，使得所述序列包含在RNA的单个连续链中。42.权利要求41所述的嵌合RNA分子，其中所述RNA分子中的所述环序列包含一个或多个与对所述植物细胞而言是内源的RNA分子互补的结合序列，和/或所述RNA分子中的所述环序列包含编码多肽或功能性多核苷酸的开放阅读框。43.根据权利要求40至42任一项所述的嵌合RNA分子，其中所述dsRNA的所述第一有义核糖核苷酸序列和所述第一反义核糖核苷酸序列的总计约5％至约40％的所述核糖核苷酸以非规范碱基对碱基配对，优选地以G:U碱基对碱基配对。44.根据权利要求40至43任一项所述的嵌合RNA分子，所述第一反义核糖核苷酸序列与所述靶RNA的区域完全互补，且所述第一有义核糖核苷酸序列与所述靶RNA的区域在序列上的不同之处在于所述靶RNA的区域中的C核苷酸被U核苷酸取代。45.根据权利要求40至44任一项所述的嵌合RNA分子，其包含第二有义核糖核苷酸序列，并且所述第一有义核糖核苷酸序列和所述第一反义核糖核苷酸序列通过包含长度为至少4个核苷酸的环序列的第一连接核糖核苷酸序列连接，由此所述第一连接核糖核苷酸序列与所述第一3
’
核糖核苷酸和第二5
’
核糖核苷酸共价连接，并且所述RNA分子还包含第二连接核糖核苷酸序列，所述第二连接核糖核苷酸序列包含长度为至少4个核苷酸的环序列，并且其与所述第二3
’
核糖核苷酸和第二有义核糖核苷酸序列共价连接。46.根据权利要求40至45任一项所述的嵌合RNA分子，其包含第二反义核糖核苷酸序列，并且所述第一有义核糖核苷酸序列和所述第一反义核糖核苷酸序列通过包含长度为至少4个核苷酸的环序列的第一连接核糖核苷酸序列连接，由此所述第一连接核糖核苷酸序列与所述第二3
’
核糖核苷酸和第一5
’
核糖核苷酸共价连接，并且所述RNA分子还包含第二连接核糖核苷酸序列，所述第二连接核糖核苷酸序列包含长度为至少4个核苷酸的环序列，并且其与所述第二3
’
核糖核苷酸和第二反义核糖核苷酸序列共价连接。47.根据权利要求40至45任一项所述的嵌合RNA分子，其包含第二有义核糖核苷酸序列和第二反义核糖核苷酸序列，其中所述第二有义核糖核苷酸序列和所述第二反义核糖核苷酸序列能够相互杂交形成第二dsRNA区域，并且所述第一有义核糖核苷酸序列和第一反义核糖核苷酸序列通过包含长度为至少4个核苷酸的环序列的第一连接核糖核苷酸序列连接，由此所述第一连接核糖核苷酸序列与所述第一3
’
核糖核苷酸和第二5
’
核糖核苷酸共价连接，并且所述RNA分子任选地包含第二连接核糖核苷酸序列，所述第二连接核糖核苷酸序列包含长度为至少4个核苷酸的环序列并且与所述第二3
’
核糖核苷酸和第二有义核糖核苷酸序列共价连接，或共价连接所述第二有义核糖核苷酸序列和第二反义核糖核苷酸序列。48.根据权利要求40至45任一项所述的嵌合RNA分子，其包含第二有义核糖核苷酸序列和第二反义核糖核苷酸序列，并且所述第一有义核糖核苷酸序列和所述第一反义核糖核苷酸序列通过第一连接核糖核苷酸序列连接，所述第一连接核糖核苷酸序列包含长度为至少4个核苷酸的环序列，从而所述第一连接核糖核苷酸序列与所述第二3
’
核糖核苷酸和第一
5
’
核糖核苷酸共价连接，并且所述RNA分子还包含第二连接核糖核苷酸序列，所述第二连接核糖核苷酸序列包含长度为至少4个核苷酸的环序列，并且与所述第一3
’
核糖核苷酸和第二反义核糖核苷酸序列共价连接，或共价连接所述第二有义核糖核苷酸序列和所述第二反义核糖核苷酸序列。49.根据权利要求45至48任一项所述的嵌合RNA分子，其中所述第二有义核糖核苷酸序列和所述第二反义核糖核苷酸序列均包含至少20个连续核苷酸长度。50.根据权利要求45至49任一项所述的嵌合RNA分子，其中所述第一和第二有义核糖核苷酸序列通过间插核糖核苷酸序列共价连接，所述间插核糖核苷酸序列在序列上与所述靶RNA分子无关，或在序列上与所述靶RNA分子相关，或者所述第一和第二有义核糖核苷酸序列共价连接而没有间插核糖核苷酸序列。51.根据权利要求45至50任一项所述的嵌合RNA分子，其中所述第一和第二反义核糖核苷酸序列通过间插核糖核苷酸序列共价连接，所述间插核糖核苷酸序列在序列上与靶RNA分子的互补体无关，或在序列上与靶RNA分子的互补体相关，或者所述第一和第二反义核糖核苷酸序列共价连接而没有间插核糖核苷酸序列。52.根据权利要求45至51任一项所述的嵌合RNA分子，其中所述第二有义核糖核苷酸序列和所述第二反义核糖核苷酸序列的总计5％至40％的核糖核苷酸以非规范碱基对碱基配对或未碱基配对，优选地以G:U碱基对碱基配对，其中所述第二dsRNA区域不包含20个连续的规范碱基对，并且其中所述RNA分子能够在真核细胞中或在体外被加工，由此所述第二反义核糖核苷酸序列被切割以产生长度为20至24个核糖核苷酸的短反义RNA(asRNA)分子。53.根据权利要求45至52任一项所述的嵌合RNA分子，其中每个连接核糖核苷酸序列的长度独立地在4至约2000个核苷酸之间，优选地每个连接核糖核苷酸序列的长度独立地在4至约1200个核苷酸之间，更优选地每个连接核糖核苷酸序列的长度独立地在4至约200个核苷酸之间，并且最优选地每个连接核糖核苷酸序列的长度独立地在4至约50个核苷酸之间。54.根据权利要求40至53任一项所述的嵌合RNA分子，其还包含5
’
前导序列或3
’
尾随序列，或两者。55.一种嵌合RNA分子，其包含第一RNA组分和与所述第一RNA组分共价连接的第二RNA组分，其中所述第一RNA组分包含第一双链RNA(dsRNA)区域和至少4个核苷酸的第一间插核糖核苷酸序列，所述第一双链RNA(dsRNA)区域包含能够相互杂交形成所述第一dsRNA区域的第一有义核糖核苷酸序列和第一反义核糖核苷酸序列，所述第一间插核糖核苷酸序列共价连接所述第一有义核糖核苷酸序列和所述第一反义核糖核苷酸序列，其中所述第二RNA组分包含第二有义核糖核苷酸序列、第二反义核糖核苷酸序列和至少4个核糖核苷酸的第二间插核糖核苷酸序列，所述第二间插核糖核苷酸序列共价连接所述第二有义核糖核苷酸序列和所述第二反义核糖核苷酸序列，其中所述第二有义核糖核苷酸序列与所述第二反义核糖核苷酸序列在所述RNA分子中杂交，其中在所述第一RNA组分中，i)所述第一有义核糖核苷酸序列由至少20个连续核糖核苷酸组成，其为按5
’
至3
’
顺序共价连接的第一5
’
核糖核苷酸、第一RNA序列和第一3
’
核糖核苷酸，ii)所述第一反义核糖核苷酸序列由至少20个连续核糖核苷酸组成，其为按5
’
至3
’
顺
序共价连接的第二5
’
核糖核苷酸、第二RNA序列和第二3
’
核糖核苷酸，iii)所述第一5
’
核糖核苷酸与所述第二3
’
核糖核苷酸碱基配对，iv)所述第二5
’
核糖核苷酸与所述第一3
’
核糖核苷酸碱基配对，v)所述第一有义核糖核苷酸序列和所述第一反义核糖核苷酸序列的总计5％至40％的所述核糖核苷酸以非规范碱基对碱基配对或者未碱基配对，以及vi)所述第一dsRNA区域不包含20个连续的规范碱基对，其中所述嵌合RNA分子能够在植物细胞中或在体外被加工，由此所述第一反义核糖核苷酸序列被切割以产生长度为20
‑
24个核糖核苷酸的短反义RNA(asRNA)分子，并且其中(d)所述嵌合RNA分子或至少一些所述asRNA分子，或两者，能够降低调节植物开花的靶RNA分子的表达或活性，或(e)所述第一反义核糖核苷酸序列包含至少20个连续核糖核苷酸的序列，所述至少20个连续核糖核苷酸的序列在序列上与所述靶RNA分子的互补体的区域具有至少50％相同性，优选在序列上与所述靶RNA分子的互补体的区域具有至少90％或100％相同性，或(f)(a)和(b)两者。56.根据权利要求40至55任一项所述的嵌合RNA分子，其中所述第一反义核糖核苷酸序列的至少20个连续核糖核苷酸都能够与所述靶RNA分子的第一区域的核苷酸碱基配对。57.根据权利要求40至56任一项所述的嵌合RNA分子，其中所述RNA分子包含两个或多个反义核糖核苷酸序列和与其碱基配对的有义核糖核苷酸序列，所述反义序列均与靶RNA分子的区域互补，优选地为完全互补。58.权利要求57所述的嵌合RNA分子，其中所述两个或多个反义核糖核苷酸序列与相同靶RNA分子的不同区域互补。59.权利要求57所述的嵌合RNA分子，其中所述两个或多个反义核糖核苷酸序列与不同靶RNA分子的区域互补。60.根据权利要求40至59任一项所述的嵌合RNA分子，其包含发夹RNA(hpRNA)结构，所述发夹RNA(hpRNA)结构具有5
’
端、长度为至少21个核苷酸的有义核糖核苷酸序列、在至少21个连续核苷酸上与所述有义核糖核苷酸序列完全碱基配对的反义核糖核苷酸序列、间插环序列和3
’
端。61.根据权利要求40至59任一项所述的嵌合RNA分子，其包含核糖核苷酸的单链，所述核糖核苷酸的单链具有5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：联邦科学技术研究组织，
类型：发明
国别省市：