一种分离猪肝干细胞的方法技术

一种分离猪肝干细胞的方法，其包括如下步骤：　　　　１）按常规方法进行猪肝大部分切除术；　　　　２）术后饲养５～１０天，每天向步骤１）处理的试验猪的腹腔注射３０～８０ｍｌ含１００　　ＩＵ抗生素的１０ｗｔ％葡萄糖溶液；　　　　３）取出试验猪的肝组织，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管，使用冷Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐溶液洗涤，剪碎肝组织块；　　　　４）加入５０ｍｌ含０．０２～０．０３ｗｔ％ＥＤＴＡ的０．０２０～０．０４０ｗｔ％胶原酶，在３７℃下于恒温振荡器上消化１５～２０分钟，加等体积Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐溶液终止消化；　　　　５）过滤除去非细胞纤维成分和消化不完全的组织块，以５００～１０００ｒｐｍ转速离心３～５ｍｉｎ，分出的上清液再以１５００ｒｐｍ转速再离心５～１０ｍｉｎ；　　　　６）向步骤５）得到的沉淀物加入５０ｍｌ的ＤＭＥＭ培养基，在３７℃于恒温振动器上消化１５～２０分钟，消化１～３次，然后以１５００ｒｐｍ转速离心８～１２ｍｉｎ；　　　　７）向步骤６）得到的沉淀物，按３ｍｌ／１０↑［８］细胞的量加入含ＮＨ↓［４］Ｃｌ的Ｔｒｉｓ缓冲溶液，处理１～５ｍｉｎ，再加入５０ｍｌ冷Ｈａｎｋ’ｓ溶液洗涤后，以１５００ｒｐｍ转速离心５～１０ｍｉｎ；　　　　８）倾出上层清液，沉淀物加入１０ｍｌ　　Ｇｅｙ’ｓ平衡盐溶液，制成细胞悬液；　　　　９）向离心管中依次加入１０ｍｌ的２８．７％ｗｔ／ｖ聚乙酰胺吡咯烷酮，１０ｍｌ　　１７．２％ｗｔ／ｖ聚乙酰胺吡咯烷酮，１０ｍｌ　　Ｇｅｙ’ｓ平衡盐溶液和１０ｍｌ步骤８）制得的细胞悬液，室温下以１５００ｒｐｍ转速离心１５～２０ｍｉｎ，收集１７．２％ｗｔ／ｖ聚乙酰胺吡咯烷酮和２８．７％ｗｔ／ｖ聚乙酰胺吡咯烷酮交界面的细胞，得到猪的肝干细胞。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及猪肝干细胞，特别是涉及。
技术介绍
科学家预言干细胞相关技术在21世纪有可能成为治疗难治性疾病的新方法。据统计，全球慢性肝炎病毒携带者总数超过3.5亿人，其中我国有1.2亿多人。临床上由于乙肝和丙肝的持续感染、酒精或其他毒物等引起的急性肝损伤、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的情况比较多见，如慢性乙肝患者2000万人。肝炎、肝硬化的发病率逐年增加，每年有成千上万的肝病患者在等待肝移植期间死亡。肝脏移植是解决晚期肝脏器质性病变的有效手段，而供体肝脏的严重不足是世界范围内的严重问题。肝细胞移植是治疗肝病的重要手段之一，它不仅维持病人正常的肝功能，而且对一些代谢失调的病人有良好的治疗作用。生物型人工肝支持系统能够为急性肝衰竭患者提供有效的肝脏解毒、代谢和生理支持功能。目前，肝细胞的来源缺乏是限制肝细胞移植和生物型人工肝广泛应用的主要障碍。成年人肝组织来源有限，人的胎肝和幼肝又涉及到伦理问题，因而，人们把注意力转向猪肝组织。猪肝组织具有以下优越性(1)来源丰富；(2)猪肝组织和人肝组织的形态与大小相近；(3)猪肝组织与人肝组织的生理和生化特性具有相似性。近些年来，国际上报道了将猪肝细胞用于生物型人工肝治疗严重肝衰竭病人，取得了令人满意的效果。在我国，北京佑安医院人工肝治疗中心和中国人民解放军总医院等单位将原代猪肝细胞应用于生物型人工肝支持系统，成功地治疗了急性肝衰竭病人。然而，猪肝实质细胞存在以下缺点①体外存活时间短；②需每次新鲜分离；③存在动物病原体污染的潜在危险性等问题。猪肝干细胞具有较强的增殖能力，体外培养存活时间长，并可分化为有功能的成熟肝细胞，污染源易控制等优点，这将为各种肝病的治疗提供新的途径，具有广泛的临床应用前景。由于肝干细胞缺乏特异性细胞表面标记物，给猪肝干细胞的分离带来很大困难。因此，必须建立良好的分离方法，获取足够量、纯度高且存活率好的猪肝干细胞，以满足基础研究和临床应用的需要。国际上猪肝干细胞研究很少。通常使用的猪肝干细胞的分离方法有如下几种1)肝组织块培养法曾被用来分离小鼠肝干细胞，如文献1Monga SP，Tang Y，Candotti F，Rashid A，Wildner O，Mishra B，Iqbal S，Mishra L.Expansion of hepatic and hematopoieticstem cells utilizing mouse embryonic liver explants.Cell Transplant.，2001，10(1)81-89所述，这种方法的缺点是分离的细胞数量少，所需时间较长；2)胶原酶消化和差速离心分离猪肝非实质细胞(这种细胞被证明为肝干细胞)，如文献2Kano J，Noguchi M，Kodama M，Tokiwa T.The in vitro differentiating capacity of nonparenchymal epithelialcells derived from adult porcine livers.Am.J.Pathol.，2000，1562033-204，文献3Kano J，Tokiwa T，Zhou X，Kodama M.Colonial growth and differentiation of epithelial cellsderived from abattoir adult porcine livers.J.Gastroenterol.Hepatol.，1998，13S62-89所述，由于肝脏包含多种非实质细胞如内皮细胞、库普弗细胞、贮脂细胞和卵圆形细胞等，因此，这种方法分离得到的肝干细胞纯度可能不高，他们的结果显示培养第1天形成的细胞丛至少包含三种非实质细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服已有技术的分离方法所获得细胞的数量少、细胞纯度低或者所需时间太长的缺陷，从而提供一种可以在短时间内分离足够量、纯度高且存活率好的分离猪肝干细胞的方法。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的本专利技术提供，其包括如下步骤1)按常规方法进行猪肝大部分切除术；2)术后饲养5～10天，每天向步骤1)处理的试验猪的腹腔注射30～80ml含100IU抗生素的10wt％葡萄糖溶液；3)取出试验猪的肝组织，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管，使用冷Hank’s平衡盐溶液洗涤，剪碎肝组织块；4)加入50ml含0.02～0.03wt％EDTA的0.020～0.040wt％胶原酶，在37℃下于恒温振荡器上消化15～20分钟，加等体积Hank’s平衡盐溶液终止消化；5)过滤除去非细胞纤维成分和消化不完全的组织块，以500～1000rpm转速离心3～5min，分出的上清液再以1500rpm转速再离心5～10min；6)向步骤5)得到的沉淀物加入50ml的DMEM培养基，在37℃于恒温振动器上消化15～20分钟，消化1～3次，然后以1500rpm转速离心8～12min； 7)向步骤6)得到的沉淀物，按3ml/108细胞的量加入含NH4Cl的Tris缓冲溶液，处理1～5min，再加入50ml冷Hank’s溶液洗涤后，以1500rpm转速离心5～10min；8)倾出上层清液，沉淀物加入10ml Gey’s平衡盐溶液，制成细胞悬液；9)向离心管中依次加入10ml的28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，10ml 17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，10ml Gey’s平衡盐溶液和10ml步骤8)制得的细胞悬液，室温下以1500rpm转速离心15～20min，收集17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮和28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮交界面的细胞，得到猪的肝干细胞。所述步骤1)的猪肝大部分切除术，其步骤如下a)按每公斤试验猪体重使用10～25mg/kg量的戊巴比妥钠，对试验猪进行腹腔麻醉；b)对所用手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒；c)剪去试验猪腹腔体表毛发，用70～75wt％酒精对试验猪体表消毒，铺巾；d)剪开表皮，再解剖腹腔；e)用止血钳固定好表皮和腹腔肌，将0.90wt％生理盐水滴加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加0.90wt％生理盐水，用无菌纱布包裹肠系膜；f)剪开肝脏包膜，使猪的左肝小叶和中叶游离出来；g)用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；h)切除肝左小叶和中叶，向腹腔补充含抗生素的生理盐水；i)分别用缝线缝合内皮和外皮。所述步骤h)的抗生素为青霉素G。所述步骤2)的抗生素为青霉素或庆大霉素。所述步骤6)的DMEM培养基包括0.008～0.012％wt/v蛋白酶E(Pronase E)、0.010～0.012％wt/v胶原酶和0.0035～0.0045％wt/v脱氧核糖酶I(DNnase I)。本专利技术提供的分离猪肝干细胞的方法使用肝大部分切除术、酶消化和密度梯度离心相结合的方法，为猪肝干细胞的基础研究和临床应用提供大量的细胞来源，与已有技术相比，其优越性在于能收获大量的猪肝干细胞，平均获得107以上的细胞；所需的时间较短；猪肝干细胞的纯度高、存活率好。附图说明图1为实施例1中的猪肝干细胞的形态特征；其中放大倍数(A)×200，(B)×200，(C)，(D)×10000；图2为使用流式细胞仪分析实施例2中的猪肝干细胞的生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丰美福，何祖平，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：