可从机体组织分离的多能干细胞制造技术

本发明专利技术的目的是提供从机体组织直接获得多能干细胞的方法及由此得到的多能干细胞。本发明专利技术涉及可从机体组织分离的SSEA-3(+)多能干细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可从机体组织分离的多能干细胞专利技术背景专利
本专利技术涉及机体组织来源的多能干细胞。
技术介绍
涡虫和蝾螈即使在其身体被切割后也可再生出完整的身体。这种高再生能力有赖于间充质组织中存在的多能干细胞的存在情况。然而，在高级生物(例如人)的情况下，组织再生能力远低于这些动物的再生能力。哺乳动物胚泡中的内细胞团(或ICM：内细胞群)被公认为是能够分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞谱系的细胞的多能干细胞集合体。然而，这种多能性随着发育进行而受到限制，随后进行特化性细胞分化，产生各种组织类型。近年来，可促进组织再生的成体干细胞或组织干细胞引起了关注。然而，尚不清楚多能干细胞是否像在涡虫或蝾螈的情况一样也存在于成熟哺乳动物机体中。据报道，具有分化成骨、软骨、脂肪细胞、神经元细胞、骨骼肌等的能力的骨髓基质细胞(MSC)部分为从成体获得的具有分化潜能的细胞(参见非专利文献1和2)。然而，骨髓基质细胞(MSC)由各种类型的细胞群组成。MSC群的分化潜能是变化的，但尚未清楚了解其主体。此外，其需要用特定化合物刺激、基因转移等以分化成特定细胞。准确地讲，需要构建用于诱导分化的系统。此外，据报道，iPS细胞(诱导多能干细胞)(参见专利文献1、专利文献2、非专利文献3等)为成体来源的多能干细胞。然而，iPS细胞的建立需要使用特殊物质进行诱导操作，例如将特定基因导入作为间充质细胞群的皮肤成纤维细胞部分(dermalfibroblast)或将特定化合物导入体细胞。专利文献1日本专利号4183742专利文献2日本专利公布(Kokai)号2008-307007A非专利文献1M.DEZAWA等，TheJournalofClinicalInvestigation，113，12，第1701-1710页，(2004)非专利文献2M.DEZAWA等，SCIENCE，2005年7月8日，309，第314-317页，(2005)非专利文献3OkitaK.等SCIENCE，2008年11月7日，322(5903)，第949-953页专利技术概述本专利技术的目的是提供从机体组织直接获得多能干细胞的方法，以及提供通过所述方法获得的多能干细胞。本专利技术人发现在涉及骨髓基质细胞(MSC：bonemarrowstromalcell)部分的研究过程中，以极低频率由未处理的(naive)人MSC细胞形成特有的细胞团。最初细胞团的外观酷似ES细胞的外观。然而，与ES细胞不同，细胞团不进行无限生长。当它们在一定时间内达到某一大小便停止生长，然后形成含有毛细胞和色素细胞等各种细胞的非均质群。另外，对这些细胞团进行免疫细胞化学分析，分别从细胞团中检出对外胚层、内胚层和中胚层标记呈阳性的不同细胞。本专利技术人从该结果中考虑在通常保持和培养的未处理(naive)人MSC细胞部分中相当于多能性/多能细胞的细胞存在的可能性。因此，本专利技术人对该问题进行了进一步的深入研究。已知当机体暴露于应激或伤害时，休眠状态的组织干细胞被激活，以促进组织再生。本专利技术人在按照各种方法(例如无血清培养、使用Hank平衡盐溶液(HBSS)培养、低氧培养、共3小时的间歇短时间胰蛋白酶培养和8小时或16小时的长时间胰蛋白酶培养)培养骨髓基质细胞(MSC)部分和皮肤成纤维细胞部分等间充质细胞时，向间充质细胞提供刺激应激，收集存活细胞，然后在含甲基纤维素(MC)培养基中进行悬浮培养(称为“MC培养”)。结果，证实了各种大小的胚状体样(embryoidbody-like)细胞团(最大直径高达150μm)的形成。特别证实了在经历长期胰蛋白酶培养的人皮肤成纤维细胞部分和人MSC部分中胚状体样细胞团形成频率最高。本专利技术人分析了在如此获得的胚状体样细胞团中的细胞性质，因此发现这类细胞具有多能干细胞的性质。本专利技术人还发现，所获得的胚状体样细胞团中的细胞具有以往已报道的多能性/多能干细胞不具备的性质。本专利技术人进一步分析了由所获得的细胞团中的细胞表达的蛋白质，因此发现细胞进行的表达模式不同于以往报道的ES细胞和iPS细胞等多能干细胞进行的表达模式。本专利技术人还发现，SSEA-3作为上述多能干细胞的表面抗原表达，并且还可使用SSEA-3表达作为标记从机体组织中分离上述多能干细胞。本专利技术人还发现，上述多能干细胞是不同于以往已报道的ES细胞和iPS细胞等多能干细胞的新的多能干细胞类型。准确地讲，本专利技术人发现，可在不需要任何诱导操作的情况下从机体组织直接获得多能干细胞。因此，本专利技术人完成了本专利技术。本专利技术称之为多能干细胞Muse细胞(Multilineage-differentiatingStressEnduring细胞(多谱系分化应激持久细胞))。本专利技术如下。[1]可从机体组织中分离的SSEA-3-阳性多能干细胞。多能干细胞可从培养的成纤维细胞和髓样干细胞等机体组织培养物中分离，而且也可以单一细胞形式分离。[2][1]的多能干细胞，其为CD105阳性的。[3][1]或[2]的CD117(c-Kit)阴性和CD146阴性的多能干细胞。[4][1]或[2]的多能干细胞，其为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性和CD271阴性的。[5][1]或[2]的多能干细胞，其为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性和Dct阴性的。[6][1]-[5]中任一项的多能干细胞，其具有低端粒酶活性或无端粒酶活性。[7][1]-[6]中任一项的多能干细胞，其能够分化成三胚层。本专利技术的多能干细胞能够通过体外贴壁培养分化成三胚层。准确地讲，通过体外诱导培养，多能干细胞可分化成皮肤、肝、神经、肌肉、骨、脂肪等三胚层的代表性细胞。另外，多能干细胞当体内移植到睾丸时能够分化成三胚层特有的细胞。此外，当通过静脉内注射到活体而移植到受损器官时，多能干细胞能够存活并分化成器官(例如皮肤、脊髓、肝和肌肉)。[8][1]-[7]中任一项的多能干细胞，其不会进行肿瘤性增殖。本专利技术的多能干细胞具有通过悬浮培养以约1.3天/细胞分裂的生长速度生长但在约10天内停止生长的性质，并且还具有当移植入睾丸时至少半年不癌化的性质。[9][1]-[8]中任一项的多能干细胞，其具有自我更新能力。本专利技术的多能干细胞可通过重复悬浮培养和贴壁培养而生长。此外，本专利技术的多能干细胞像其它体干细胞的情况一样经历不对称分裂。[10][1]-[9]中任一项的多能干细胞，其对应激有抗性。[11][1]-[10]中任一项的多能干细胞，其具有高吞噬能力。[12][1]-[11]中任一项的多能干细胞，其对下列22种气味受体的至少一种呈阳性：嗅觉受体，家族8，亚家族G，成员2(OR8G2)；嗅觉受体，家族7，亚家族G，成员3(OR7G3)；嗅觉受体，家族4，亚家族D，成员5(OR4D5)；嗅觉受体，家族5，亚家族AP，成员2(OR5AP2)；嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员4(OR10H4)；嗅觉受体，家族10，亚家族T，成员2(OR10T2)；嗅觉受体，家族2，亚家族M，成员2(OR2M2)；嗅觉受体，家族2，亚家族T，成员5(OR2T5)；嗅觉受体，家族7，亚家族D，成员4(OR7D4)；嗅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.15 US 61/213788;2009.12.24 US 61/2901591.一种包含SSEA-3(+)多能干细胞的细胞部分，所述细胞部分使用SSEA-3的表达作为指标从活体的中胚层组织或间充质组织中获得，所述细胞部分包含具有以下性质的SSEA-3(+)多能干细胞：(i)所述细胞具有低的端粒酶活性或无端粒酶活性；(ii)所述细胞能够分化成三胚层；(iii)所述细胞不出现肿瘤性增殖；(iv)所述细胞具有自我更新能力；并且(v)所述细胞为CD117阴性、CD146阴性、CD34阴性、vWF阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性和Dct阴性的。2.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞为CD105阳性的。3.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞为CD117阴性和CD146阴性的。4.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性和CD271阴性的。5.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性和Dct阴性的。6.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞对应激有抗性。7.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞具有高吞噬能力。8.权利要求1的细胞部分，其中活体的间充质组织是皮肤或骨髓。9.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞以悬浮培养和贴壁培养的组合培养增殖。10.一种用于从活体的中胚层组织或间充质组织中获得权利要求1-9中任一项的细胞部分的方法，所述方法包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：出泽真理，藤吉好则，锅岛阳一，若尾昌平，
申请(专利权)人：出泽真理，藤吉好则，锅岛阳一，若尾昌平，北田容章，
类型：
国别省市：