大鼠胰岛细胞分离纯化的改良方法技术

本发明专利技术涉及细胞生物学技术领域，是包括涉及用新型Ｌｉｂｅｒａｓｅ　　ＲＩ酶灌注消化大鼠胰腺，和利用聚蔗糖Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度离心分离大鼠胰岛细胞的方法。本发明专利技术将Ｌｉｂｅｒａｓｅ　　ＲＩ酶原位灌注大鼠胰腺使之完全膨胀，钝性分离胰腺并置于３７℃水浴静止消化。消化物经两层不锈钢筛过滤后，用Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度（２５％，２３％，２１％和１１％）离心纯化胰岛细胞。初步纯化的胰岛细胞培养过夜后，用连有橡皮管的玻璃针经操作者口腔及舌头的控制逐一挑出，从而得到完全纯净的大鼠胰岛细胞，得率１３５１＋２３个／胰腺，胰岛细胞进一步用二苯基硫巴腙染色证实。本发明专利技术极大地提高了传统分离方法的得率和效率，为降低大规模分离纯化人胰岛的成本奠定了基础，这对晚期糖尿病人的胰岛细胞移植具有重要的实践开拓意义。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种大鼠胰岛细胞的分离纯化方法，其特征在于：ａ．大鼠胰腺的钝性分离及消化：大鼠麻醉后开腹，结扎胆总管入十二指肠端。破心放血，立即用０．１６７ｍｇ／ｍｌ的ＬｉｂｅｒａｓｅＲＩ酶溶液经胆总管实行胰腺在体原位快速灌注，待胰腺完全膨胀后 进行钝性分离。把胰腺放入５０ｍｌ离心管，加入适量消化液置于３７℃水浴静止消化２７．５ｍｉｎ。消化结束后用漩涡振荡器剧烈振荡离心管１０ｓ，加入等量冷ＰＢＳ终止消化。消化物经两层不锈钢筛（孔径分别为直径１ｍｍ和０．５ｍｍ）过滤，离心去上清，得到糜状消化终产物；ｂ．胰岛细胞的初步纯化：往消化终产物中加入４ｍｌ２５％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ溶液，振荡混匀，上面逐层加入２３％，２１％和１１％的Ｆｉｃｏｌｌ溶液各２ｍｌ，形成界面清晰的密度梯度分离液。用吊桶式转头进行离心分离，整个过 程不使用刹车，自然加速和减速。在２１％和１１％的界面中把细胞团吸出，得到初步纯化的胰岛细胞；ｃ．胰岛细胞的精细纯化：初纯化的胰岛细胞培养过夜，第二天用连有橡皮管的玻璃针把胰岛细胞逐一挑出，这个过程需要操作者口腔和舌头的紧密配合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘畅，张春妮，王军玲，张辰宇，项阳，张燕，朱凌云，戚小强，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]