【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及rna测序领域，具体地涉及基于三代测序技术的靶向rna测序方法及系统。
技术介绍
1、针对特定转录本的靶向检测是临床诊断、病原鉴定、变异检测和免疫组库分析领域的共同需求。目前的靶向rna测序方法通常采用实验富集、探针捕获或扩增子测序的策略来富集靶向转录本。然而，这些实验方法大多需要专业的分子生物学知识，针对具体富集目标设计复杂的生化实验处理，且富集效率会受到各种实验效果及批次效应的影响。此外，基于探针捕获和扩增子测序的方法依赖成本较高的探针阵列合成，仅能用于特定基因组区域的检测，难以拓展到不同的目的转录本。因此，现有的靶向rna测序方法均难以快速扩展到不同类型转录本，无法实现对任意目标的灵活富集策略。同时，在测序前的富集过程中，丢失了全转录组中大量非目的转录本的多样性和丰度信息，导致目的基因的定量结果与真实表达量存在系统偏差，极大地影响了现有靶向rna测序方法的应用与数据整合分析。
2、
技术介绍
中的信息仅仅在于说明本专利技术的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供了一种灵活、高效的靶向转录组测序方案，并且可以获得无偏的全转录组定量结果。通过结合多路转录组以及纳米孔适应性测序技术，本专利技术可以实现针对全转录组任意目的基因的靶向检测。本专利技术的方法不依赖任何复杂的实验富集处理，仅需用户提供特定序列或基因组区域作为富集目标。在优选的实施方案中，与纳米孔测序软件中提
2、本专利技术的第一方面，提供一种基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其包括以下步骤：
3、(1)在去除核糖体rna的总rna样本中，利用多路反转录法取得全转录组的全长cdna；
4、(2)将所述全转录组的全长cdna片段进行环化和滚环扩增，并根据片段大小筛选得到目标产物，利用目标产物构建纳米孔测序文库；
5、(3)在上机测序时，选择性富集靶标转录本；和
6、(4)同时获得靶标与非靶标分子的丰度信息，进而评估转录本的真实丰度信息。
7、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其中，步骤(1)包括使用双链oligo(dt)、双链随机引物以及单链随机引物对poly(a)转录组、非poly(a)转录组以及环状rna分子进行同时捕获的步骤。
8、在示例性实施方案中，本专利技术的多路反转录包括：
9、向10μl rna中加入3μl 10x nebnext quick ligation reaction buffer，0.5μl双链oligo dt引物，与1.5μl t4 dna连接酶混合液，在25℃下孵育10min；
10、加入0.5μl双链随机引物，在25℃下孵育10min；
11、加入10μl无核酸水，8μl 5x first-strand buffer，2μl dtt，2μl dntp，1μlsmarter ii a引物，1μl rnase抑制剂与1μl smarter反转录酶，在42℃下孵育60min；
12、加入0.5μl单链随机引物，在25℃下孵育10min，42℃孵育60min；
13、将合成的cdna产物进行磁珠纯化，并进行pcr扩增；
14、加入longamp taq 2x master mix与扩增引物，在95℃下孵育30s；
15、在95℃下反应15s，62℃下反应15s，65℃下反应90s；
16、重复步骤(2)14-15次；
17、65℃下反应5min；
18、用磁珠纯化pcr产物。
19、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其中，步骤(2)包括使用辅助模板接头对反转录产生的cdna进行环化，随后对环化cdna进行滚环扩增，使滚环扩增产物长度增加5倍以上，根据产物长度获得目标产物。
20、在示例性实施方案中，本专利技术的cdna环化的步骤如下：
21、向扩增产物中加入环化接头与nebuilder hifi dna assembly master mix，在55℃下反应60min；加入0.3μl外切酶iii与0.1μl外切酶i，在37℃下反应60min；用磁珠纯化环化产物。
22、在示例性实施方案中，本专利技术的滚环扩增包括：
23、向环化产物中加入5μl 10x phi29 buffer,10μl dntp,1μl随机引物，0.5μl bsa,29μl超纯水，1μl phi29聚合酶，在30℃下过夜反应；用0.5:1的磁珠纯化筛选dna片段。
24、在某些实施方案中，本专利技术的步骤(2)进一步包括脱支处理步骤，其包括：
25、磁珠用75％乙醇清洗两次；加入t7 reaction mix，重悬；在37℃，1800rpm转速下反应40min；将样本置于磁力架，待溶液澄清后，取上清；向上清中加入1:0的磁珠，纯化dna片段；用bluepippin筛选7k以上大小的dna片段。
26、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其中，步骤(2)中筛选得到的目标产物长度为7kb以上。
27、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其中，步骤(3)包括以固定间隔时间接收测序电信号，进行碱基识别，获取已测序序列信息；将已测序序列比对至指定参考序列集，判断序列是否为靶标分子；和针对非靶标分子，返回控制信号，停止测序。
28、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其中，所述三代测序技术为纳米孔测序技术。
29、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其中，步骤(4)包括获得对目的转录本测序产生的全长读段，组装全长转录本结构；获得对非目的转录本测序产生的非全长读段，利用序列比对的策略，获得其对应转录本的信息；利用下述算法，获得全转录组所有分子的丰度：
30、对于共有n个转录本的目的转录本队列，转录本i的相对表达丰度pi由下式估计：
31、
32、其中si,fl为使用salmon软件计算的来自转录本i的全长读段数量，随后，当同时考虑全长测序读段与非全长被拒读段，转录本i的最终读段数量为
33、
34、其中si,fl+nonfl为分配至转录本i的全长读段与非全长读段数之和，最终，使用cpm指标评估目的转录本的丰度：
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【技术保护点】
1.一种基于三代测序技术的靶向RNA测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于三代测序技术的靶向RNA测序方法，其特征在于，步骤(1)包括使用双链oligo(dT)、双链随机引物以及单链随机引物对poly(A)转录组、非poly(A)转录组以及环状RNA分子进行同时捕获的步骤。
3.根据权利要求1所述的基于三代测序技术的靶向RNA测序方法，其特征在于，步骤(2)包括使用辅助模板接头对反转录产生的cDNA进行环化，随后对环化cDNA进行滚环扩增，使滚环扩增产物长度增加5倍以上，根据产物长度获得目标产物。
4.根据权利要求1所述的基于三代测序技术的靶向RNA测序方法，其特征在于，步骤(2)中筛选得到的目标产物长度为7kb以上。
5.根据权利要求1所述的基于三代测序技术的靶向RNA测序方法，其特征在于，步骤(3)包括以固定间隔时间接收测序电信号，进行碱基识别，获取已测序序列信息；将已测序序列比对至指定参考序列集，判断序列是否为靶标分子；和针对非靶标分子，返回控制信号，停止测序。
6.根据权利要求1所述的
7.根据权利要求1所述的基于三代测序技术的靶向RNA测序方法，其特征在于，步骤(4)包括获得对目的转录本测序产生的全长读段，组装全长转录本结构；获得对非目的转录本测序产生的非全长读段，利用序列比对的策略，获得其对应转录本的信息；利用下述算法，获得全转录组所有分子的丰度：
8.一种基于三代测序技术的靶向RNA测序系统，其特征在于，包括：
9.根据权利要求8所述的基于三代测序技术的靶向RNA测序系统，其特征在于，进一步包括可编程的控制系统，用于对测序过程进行实时控制。
10.根据权利要求8所述的基于三代测序技术的靶向RNA测序系统，其特征在于，所述数据处理器存储有用于获得全转录组所有分子丰度的算法，当其运行时执行以下操作：获得对目的转录本测序产生的全长读段，组装全长转录本结构；获得对非目的转录本测序产生的非全长读段，利用序列比对的策略，获得其对应转录本的信息；
...【技术特征摘要】
1.一种基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其特征在于，步骤(1)包括使用双链oligo(dt)、双链随机引物以及单链随机引物对poly(a)转录组、非poly(a)转录组以及环状rna分子进行同时捕获的步骤。
3.根据权利要求1所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其特征在于，步骤(2)包括使用辅助模板接头对反转录产生的cdna进行环化，随后对环化cdna进行滚环扩增，使滚环扩增产物长度增加5倍以上，根据产物长度获得目标产物。
4.根据权利要求1所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其特征在于，步骤(2)中筛选得到的目标产物长度为7kb以上。
5.根据权利要求1所述的基于三代测序技术的靶向rna测序方法，其特征在于，步骤(3)包括以固定间隔时间接收测序电信号，进行碱基识别，获取已测序序列信息；将已测序序列比对至指定参考序列集，判断序列是否为靶标分子；和针对非靶标分子，返回控制信号，停...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵方庆，张金阳，左振强，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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