本发明专利技术涉及棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、重组及功能分析，属于分子生物学和生物技术领域。以棉花衰老叶片的ｃＤＮＡ为模板，根据其它植物中已经克隆半胱氨酸蛋白酶基因中氨基酸的保守序列，设计兼并引物，进行聚合酶链反应，将扩增的ＤＮＡ片段回收后，与ｐＧＥＭ－Ｔ载体进行连接，转化大肠杆菌，筛选重组子，进行序列分析。然后进行３′和５′末端快速扩增获得全长ｃＤＮＡ，进一步，构建反义表达载体，转化拟南芥。与野生型相比较，转基因拟南芥的衰老延缓。因此，该基因可以转入棉花、小麦和玉米等农作物中，以克服这些农作物早衰的现象，提高农作物的产量和品质，具有重要的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及棉花半胱氨酸蛋白酶基因(Ghcysp)的克隆、重组及功能分析和应用，属于分子生物学和生物
技术介绍
在棉花生产中，棉花叶片早衰普遍存在，棉田叶片早衰一般导致产量损失10％左右，严重早衰的棉田产量损失达20％以上。棉花叶片的早衰不仅影响棉花的产量，而且导致棉花纤维强度降低、长度变短、整齐度下降，从而降低棉纤维的成纱质量，因此，棉花生产迫切需要延缓棉花早衰的技术和方法。细胞程序性死亡是遗传控制、高度有序的细胞自杀过程，可使生物清除衰老的细胞，是多细胞真核生物在生长发育过程中保持体内环境的稳定所必须的，大量实验证明动物的一些疾病是由于细胞程序性死亡发生异常造成的(Polverini，P.J.，and Nr，J.E.Apoptosis andpredisposition to oral cancer.Crit.Rev.Oral Biol.Med.1999，10139-152.。Wang，T.H.，and Wang，H.S.Apoptosis(2)Characteristics ofapoptosis.J.Formos.Med.Assoc.1999，98531-542.)。植物的早衰(pre-mature)是否也与植物细胞程序性死亡发生异常有关？目前还没有实验验证。在动物的细胞程序性死亡中，Caspases(cysteineaspartases)蛋白酶起着重要的作用(Vaux and Korsme，The molecularbiology of leaf senesence.Journal of Experiment Botany，1997，48(307)181-199。Hengartner，The biochemistry of apoptosis.Nature，2000，407770-776。)，Caspase蛋白酶的命名是根据它的酶活性位点是Cys，水解蛋白质酶切位点在天冬氨基酸后，它是一类半胱氨基酸蛋白酶，它在动物细胞程序性死亡中既是水解蛋白质的参与者，也是细胞程序性死亡的启动因素。在植物衰老过程中，细胞程序性死亡广泛存在(Bleecker，A.B.，and Patterson，S.E.Last exitSenescence，abscission，andmeristem arrest in Arabidopsis.Plant Cell，1997，91169-1179。Schmid，M.，Simpson，D.，Sarioglu，H.，Lottspeich，F.，and Gietl，C.Thericinosomes of senescing plant tissue bud from the endoplasmic reticulum.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001，985353-5358)，目前，已经从拟南芥(Eason，J.R.，Ryan，D.J.，Pinkney，T.T.，and O′Donoghue，E.M.Programmed cell death during flower senescenceIsolation andcharacterization of cysteine proteinases from Sandersonia aurantiaca.Funct.Plant Biol，2002，291055-1064.)、番茄(Draham R，John I，FarrellA，Cooper W，Schunch W，Grierson D，Isolation and analysis of cDNAsencoding tomato cysteine proteases expressed during leaf senescence，Plant Molecular Biology，1996，30755-767.)、胡萝卜和玉米(Smart etal.The timing of maize leaf senesence and characterisation ofsenesence-related cDNAs.Phsiology Plantrum，1995，93(1)673-682)中分离得到了类似动物Caspases蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶基因，在植物发育早期半胱氨酸蛋白酶基因的表达量比较低，在衰老的植物器官表达量增加。但是，在棉花中目前还没有克隆到该基因。本专利技术的目的是克隆棉花的半胱氨酸蛋白酶基因，通过构建反义表达载体，抑制该基因的表达，以延缓棉花及其它植物的早衰。
技术实现思路
本专利技术以辽棉9号衰老叶片的cDNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术，克隆了棉花半胱氨酸蛋白酶基因，通过构建反义表达载体，利用农杆菌侵染转化拟南芥，转基因植株的衰老比野生型延迟9-10天。辽棉9号吐絮后，叶片变黄进入衰老时期时，提取衰老叶片的总RNA，取2微克RNA进行反转录合成cDNA。利用Blast软件，对Genebank中已经克隆的不同植物半胱氨酸蛋白酶的进行同源性比较，结果发现半胱氨酸蛋白酶的羧基端有两段比较保守的氨基酸序列，根据这两段保守序列的氨基酸顺序，设计了1对兼并引物，分别为C-A和C-B{5’TG(A/G)AA(G/C)AC(T/A)CC(C/A/T)GA(A/T)GA(G/A)TA(A/G)AA(C/T)TG 3’}。以衰老叶片的cDNA为模板，利用这一对兼并引物进行RT-PCR进行扩增，扩增反应条件为PCR反应体积为50μl，包括以下成分10×反应缓冲液5μl2.5mMdNTP 4μl5′端引物(5μM) 4μl3′端引物(5μM) 4μl反转录产物4μlTap酶(2.5u) 0.5μl反应条件为 取2μl PCR产物，与pGEM-T载体(Promega公司产品)进行连接，转化大肠杆菌(Promega公司产品)，筛选重组子，然后进行序列分析。根据已经克隆的DNA序列设计特异引物，以衰老叶片的cDNA为模板，进行3′RACE分离其3′序列，进行5′RACE扩增，以分离5′序列，然后，将它们与保守片段进行拼接成一个完整的cDNA序列。根据该cDNA的5’和3′的核苷酸序列，设计一对特异引物Ghc-1 5’AAAACC CCA CTT CAAAAC CC 3’Ghc-2 5’GCA CAC GAT TCA TTC ATAAC 3’利用这一对特异引物，以衰老叶片的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，按照同上扩增条件，结果分离的得到一段1300bp左右的片段，对该片段进行序列分析表明其基因序列的长度为1368bp，将该cDNA命名为Ghcysp，它包含一个1034bp的开放阅读框，起始于序列的99位，终止于1133位，编码344个氨基酸，5′端非编码区的长度为98bp，3’端非编码区的长度为235bp。在Poly A上游75bp处有典型的真核生物基因Poly A的信号序列-AATAAA，起始密码子ATG附近具有5’-CACAATGG序列结构，与其他真核生物中普遍存在的高效转录起始序列5’-CA/GNNATGG一致。Ghcysp基因与其它动、植物编码半胱氨酸蛋白酶的核苷酸序列的同源性为46％-66％，Ghcysp基因与其它动、植物半胱本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码半胱氨酸蛋白酶的核酸，其具有：（ａ）序列ＳＥＱＩＤＮｏ．１；（ｂ）基于密码子的兼并性与（ａ）编码相同蛋白酶的序列；或（ｃ）与（ａ）的同源性大于６５．４％的核酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：喻树迅，沈法富，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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