本发明专利技术公开了一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因与应用，其目的是提供一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因与表达该融合蛋白的方法以及以该融合蛋白为活性成分的减肥及治疗肥胖症的药物。本发明专利技术所提供的具有减肥作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：１）序列表中的ＳＥＱ ＩＤ Ｎ↓［ｏ］：１；２）将序列表中ＳＥＱ ＩＤ Ｎ↓［ｏ］：１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质；３）序列表中的ＳＥＱ ＩＤ Ｎ↓［ｏ］：２；４）将序列表中ＳＥＱ ＩＤ Ｎ↓［ｏ］：２的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质。该融合蛋白稳定性高、半衰期较长，在医学上具有较高的安全性及较好的疗效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因与表达该融合蛋白的方法以及以该融合蛋白为活性成分的药物。
技术介绍
睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)，因发现其具有促进鸡胚睫状体神经节副交感神经元存活的作用而得名。随后的研究表明CNTF是一种具有多种生物学功能的细胞因子能促进感觉神经元、运动神经元、大脑神经元和海马神经元的存活；能够促进交感神经元的胆碱能分化，促进神经胶质祖细胞分化为星形胶质细胞；还能促进少突胶质细胞的生长和存活；此外，CNTF对一些外周组织如骨骼肌的生长也有促进作用。1994年，Henderson等人发现全身性地注射CNTF可引起小鼠消瘦，随后在治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的临床研究中也观察到重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)能使病人体重下降。但是，这种作用在当时被认为是一种不良的副作用。随着CNTF受体(CNTFRα)及瘦素(Leptin)受体(Ob-R)基因相继得到克隆，Chen等人发现CNTF受体复合物中负责信号转导的成员gp130和LIFRβ与Ob-R的基因序列具有相似性。Baumann等人还发现gp130与Ob-R甚至具有相似的信号转导能力。以上研究又促使Gloaguen等人去探索CNTF与Leptin是否具有相似的减肥机制。Gloaguen等人首先用神经元细胞系证明了CNTF与Leptin可以激发相似的信号转导通路，随之用ob/ob、db/db以及膳食致肥的(DIO)小鼠动物模型做实验也证实了CNTF的减肥效果。Lambert等人则进一步证明了CNTF与Leptin可通过小鼠下丘脑激发相似的信号转导通路，并证实了CNTF在促使减肥的同时并没有发热、厌食及代谢异常等副作用发生，从而证明了CNTF的减肥作用并不是一种不良的副作用。CNTF作为一种天然的与Leptin类似的物质(模拟物)，有效地弥补了Leptin的耐受问题，因而在肥胖症的治疗上具有良好的应用前景。AX15是由Regeneron公司专利技术的人睫状神经营养因子(hCNTF)的一个三重突变体第17位的Cys被Ala替换，第63位的Gln被Arg所替换，C末端缺失15个氨基酸。与天然hCNTF相比，AX15具有更高的生物学活性，更高的稳定性和可溶性。目前用AX15已完成了肥胖症治疗的III期临床实验，并取得了具有显著差异的统计学结果。AX15(R13K)是赵洪亮等构建的KEX2蛋白酶抗性的AX15突变体，在体外和体内活性测定中都显示了与AX15相当的生物学活性(蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体及其生产方法和用途，中国专利技术专利申请号2003101001380；赵洪亮等.蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达，生物工程学报，2004，20(3)394-397)。然而CNTF及其突变体的半衰期较短，只有频繁的给药才能获得令人满意的疗效，如在临床研究中往往采用每天注射一次的用药方式。但如此频繁的用药方式再加上较长的治疗周期使得病人较难承受。因此迫切需要研制出作用时间长的CNTF及其突变体。人血清白蛋白(HSA)是机体中一种稳定的且半衰期较长的蛋白。研究表明许多蛋白药物与该白蛋白交联或融合后可以显著地使药物蛋白的半衰期延长，从而使用药次数减少。目前HGS(Human Genome Sciences)公司已专利技术了白蛋白融合生长激素(Albutropin)，白蛋白融合粒细胞集落刺激因子(Albugranin)及白蛋白融合干扰素(Albuferon)等产品并先后进入了I/II期临床研究，研究结果表明上述产品具有较长的体内半衰期，较高的安全性及较好的疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因。本专利技术所提供的具有减肥作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质；3)序列表中的SEQ ID №2；4)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质。其中，具有序列表中的SEQ ID No1的氨基酸残基序列的蛋白质名称为HSA-AX15(R13K)；具有序列表中的SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质名称为AX15(R13K)-HSA。序列表中的SEQ ID №1由804个氨基酸残基组成，自氨基端第1-609位为HSA的氨基酸残基序列，自氨基端第621-804位为AX15(R13K)的氨基酸残基序列，自氨基端第610-620位为连接肽序列。序列表中的SEQ ID No2由774个氨基酸残基组成，自氨基端第1-184位为AX15(R13K)的氨基酸残基序列，自氨基端第190-774位为HSA的氨基酸残基序列，自氨基端第185-189位为连接肽序列。上述具有减肥作用的融合蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的序列3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；5)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；6)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；7)与序列表中SEQ ID No4限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；8)在高严谨条件下可与序列表中的序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。序列表中的SEQ ID №3由2415个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第2415位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQID №4由2325个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第2325位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。含有本专利技术基因的表达载体、细胞系及工程菌均属于本专利技术的保护范围。扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的另一个目的是提供一种表达上述具有减肥作用的融合蛋白的方法。本专利技术所提供的表达上述具有减肥作用的融合蛋白方法，是将含有上述具有减肥作用的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有减肥作用的融合蛋白。所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为酵母菌。所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115，KM71(可购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(可购自美国Invitrogen公司)。所述大肠杆菌可为E.coli JM109，E.coliHB101，E.coli Top10。用于构建所述重组酵母表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有减肥作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：１）序列表中的ＳＥＱＩＤ№：１；２）将序列表中ＳＥＱＩＤ№：１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质； ３）序列表中的ＳＥＱＩＤ№：２；４）将序列表中ＳＥＱＩＤ№：２的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘志敏，赵洪亮，薛冲，张伟，熊向华，杨秉芬，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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