一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，该方法包括如下步骤：（１）将菘蓝种子接种到ＭＳ培养基中获得无菌苗外植体；（２）将发根农杆菌接入ＹＥＢ培养基中，制备所需的菌液；（３）将外植体通过预培养后，浸入已活化的农杆菌菌液中，利用超声波辅助，使外植体与农杆菌充分接触后，取出外植体转入筛选培养基上进行毛状根的诱导培养；（４）将获得的转基因毛状根进行增殖培养。本发明专利技术取消了共培养步骤，增加了用含有抗生素的脱菌水清洗外植体，从而使转化外植体的存活率明显增高，转化时间也明显缩短，降低了转化成本；另外由于在用农杆菌浸染外植体时，利用了超声波作辅助，因此提高了转化率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种农杆菌介导的植物转基因方法，特别是涉及一种农杆 菌介导的菘蓝转基因方法。
技术介绍
十字花科(Crucifeme)植物菘蓝(Isatis indigotica Fort)是我国南北各 地广泛种植的一种大宗中草药，其根和叶是常用中药板蓝根和大青叶的主 要来源。板蓝根在临床上用途较广，除板蓝板注射液外，主要常与其它中 药组成复方广泛用于治疗多种疾病如流感、腮腺炎、乙脑、肝炎，是公认 的有较好抗病毒效果的中药之一，此外，还具有抗炎、免疫调节、抗菌、 解热、缓痛等药理作用。80年代开始利用根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(Agrobacterium) 的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染大多数双子叶植物和少数单 子叶植物，甚至是裸子植物而诱发植物产生毛状根。发根农杆菌中含有致 使植物产生毛状根的Ri质粒，在Vir区基因产物协助下，Ri质粒中的T-DNA 片段能转移进植物核基因组中，导致转化成功的植物产生大量的毛状根。 毛状根具有生长速度快，不需要添加外源激素，并能提供大量可药用的次 生代谢产物的特征。农杆菌Ri质粒上携带的生根基因不仅能使被感染植物 部位产生大量的毛状根，而且由产生的毛状根还可以获得再生的转化植株， 这些植株可表现出许多稳定遗传的表现变异，在植物品种的改良方面具有 较广阔的应用前景。目前已有农杆菌介导的植物转基因方法申请了专利，如申请号为200510037948.5的"一种杨树的农杆菌基因转化方法"等，这些方法目前 存在如下问题 一是都包含有共培养步骤，因此转化步骤多，花费时间长， 转化成本高；二是外植体除菌是通过在增殖培养基或/和筛选培养基中加入 抗生素来实现的，因而只能去除与培养基相接触的表面上的细菌，其它未 与培养基接触的表面上的细菌则不能去除，因此除菌效果不佳，存活率低； 三是转化率较低。本专利技术的目的是提供一种转化率高、转化成本低、除菌效果好的农杆 菌介导的菘蓝转基因方法，该方法取消了共培养步骤。为达到上述目的，本专利技术采用的解决方案包括如下步骤将农杆菌划线接种于YEB固体培养基上培养1 2天后，用牙签挑取 生长好的单菌落于YEB液体培养基中震荡培养；将菘蓝种子先用无菌水浸泡，再用消洗灵浸泡，然后用无菌水冲洗2 4次，再用1%。的升汞消毒，并在消毒后用无菌水冲洗2 4次，最后用无 菌滤纸吸干水分，接种于MS固体培养基中，在光照条件下进行培养；将上述获得的菘蓝无菌苗切成约1 2cm长的外植体，接种于MS固体 培养基中预培养12 48小时，然后放入上述制得的农杆菌菌液中，在超声 波的辅助下振荡浸泡，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，用无菌 滤纸吸干外植体表面多余的菌液，转入筛选培养基中诱导毛状根，当筛选 培养基上出现农杆菌菌斑时，取出外植体先用无菌水冲洗2 4次，再用含 有抗生素的脱菌水除菌，然后用无菌滤纸吸干水后，接入新配制的筛选培 养基上继续诱导培养，直至产生毛状根；将上述获得的毛状根接入液体增殖培养基中培养，产生大量的毛状根。上述菘蓝种子先用无菌水浸泡2 6小时后，再用0.02%的消洗灵浸泡 2 6min， 1%。的升汞消毒1 2次，每次3 5min。所采用的农杆菌为发根农杆菌ATCC15834或Ril601 ，培养温度为25 30°C，所培养的农杆菌菌液OD6(xr0.3 0.8。上述菘蓝外植体在农杆菌菌液中浸泡8 15min，其中用超声波辅助超 声作用为1 3min。上述筛选培养基是1/2MS+头孢噻肟钠200 500mg/L+琼脂6 8g/L +蔗糖15 25§/1^，诱导毛状根的培养温度为25 3(TC，光照强度为1500 2000Lx，每天光照8 16小时。上述脱菌水为含200 500mg/L头孢噻后钠的抗菌素水，用脱菌水除菌 的时间为3 10min。上述MS固体培养基为MS+琼脂6 8g/L+蔗糖20 30g/L，培养温度 为25 28'C，光照强度为1500 2000Lx，每天光照8 16小时。本方案中毛状根最好采用液体培养基进行增殖培养，所选择的液体增 殖培养基为1/2MS+头孢噻肟钠200 500mg/L+蔗糖15 25g/L。本专利技术具有如下效果(1) 取消了共培养步骤，将浸染后的外植体直接接入含有抗生素的筛选 培养基中，大大地减少了除菌环节，并由此节约了大量的药品，降低了转 化成本；另外，增加了用含有抗生素的脱菌水清洗带有农杆菌的外植体， 并用无菌滤纸吸干植物体表面的水分，可使转化外植体的存活率增高30% 以上，从而使得毛状根的诱导率也明显增高。(2) 在用农杆菌浸染外植体时，利用了超声波作辅助，从而使外植体与 农杆菌能充分接触，可提高转化率20%以上；(3) 操作简单、易推广。具体实施例方式实施例1 (l)菌种及其活化将发根农杆菌ATCC15834划线接种于YEB固体培养基上，27。C活化2次后用牙签在培养基上挑取生长好的单菌落于YEB液体培养基中，在27°C 、 100r/min的条件下震荡培养24小时，至OD6。。=0.4 0.5时，即可用于浸染;(2) 无菌苗的获得选取饱满的菘蓝种子先用无菌水浸泡5小时，再用0.02%的消洗灵浸泡 3min，然后用无菌水洗涤4次，再在超净工作台上用1%。的升汞洗涤两次， 每次2min，然后用无菌水洗涤4次，放于无菌滤纸上吸干表面多余水分后， 放入固体培养基MS+琼脂6 8g/L+蔗糖20 30g/L中，在27'C、每天光照 16小时，光照强度为1800Lx的条件下进行培养，7天即可得到无菌苗；(3) 转化培养选择健壮的无菌苗，用手术刀将其切割成子叶、下胚轴、带子叶下胚 轴三种长约1 2cm左右的外植体，子叶在主脉上切伤处理。将外植体接种 于固体培养基MS+琼脂6 8g/L+蔗糖20 30gL中预培养24小时后，放入 (l)步骤培养的农杆菌菌液中浸泡15min，其中辅以超声波仪超声处理的时 间为2min，然后取出外植体，用无菌滤纸吸干植物体表面多余的菌液，放 入筛选培养基1/2MS+头孢噻肟钠300mg/L+琼脂6 8g/L+蔗糖15 25g/L， 在27。C暗培养1天后见光培养，光照强度为1800Lx，每天光照12小时， 当筛选培养基上产生农杆菌菌斑时，立即用无菌水洗涤3次，再用含有 300mg/L头孢噻肟钠的脱菌水浸泡5min，然后用无菌滤纸吸干植物体表面 多余的水分，放入新配制的筛选培养基上再培养，直到产生毛状根；(4) 毛状根的增殖培养将(3)步骤获得的毛状根切成3cm长，放入液体增殖培养基1/2MS+头 孢噻肟钠300mg/L+蔗糖15 25g/L中，在，27'C，光照强度1800Lx，每天 光照15小时条件下培养25天，产生大量的毛状根，经PCR鉴定，发根农 杆菌含有的RiT-DNA已整合入菘蓝基因组中并得到表达。本实施例的转化 率可达70%。实施例2本实施例除农杆菌选用Ril6021夕卜，其它步骤与实施例1相同。本实 施例的转化率为48%，说明Ril601的效果不如ATCC15834好。 实施例3本实施例中筛选培养基和增殖培养基中抗生素头孢噻肟钠的浓度为 200mg/L，其它步骤与实施例l相同。经观察发现，转化外植体的染菌率高 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种农杆菌介导的菘蓝转基因方法，其特征在于包括下述步骤：将农杆菌划线接种于ＹＥＢ固体培养基上培养１～２天后，用牙签挑取生长好的单菌落于ＹＥＢ液体培养基中震荡培养；将菘蓝种子先用无菌水浸泡，再用消洗灵浸泡，然后用无菌水冲洗２～４次，再用１‰的升汞消毒，并在消毒后用无菌水冲洗２～４次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种于ＭＳ固体培养基中，在光照条件下进行培养；将上述获得的菘蓝无菌苗切成约１～２ｃｍ长的外植体，接种于ＭＳ固体培养基中预培养１２～４８小时，然后放入上述制得的农杆菌菌液中，在超声波的辅助下振荡浸泡，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，转入筛选培养基中诱导毛状根，当筛选培养基上出现农杆菌菌斑时，取出外植体先用无菌水冲洗２～４次，再用含有抗生素的脱菌水除菌，然后用无菌滤纸吸干水后，接入新配制的筛选培养基上继续诱导培养，直至产生毛状根；将上述获得的毛状根接入液体增殖培养基中培养，产生大量的毛状根。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃华，何俊蓉，孙雁霞，邬晓勇，徐文俊，张海强，
申请(专利权)人：成都大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]