从鱼类肠系膜脂肪组织中克隆鱼类ob基因的方法技术

本发明专利技术涉及从鱼类肠系膜脂肪组织中克隆鱼类ｏｂ基因的方法。解决了采用现有克隆技术较难克隆出鱼类ｏｂ基因的问题。本发明专利技术方法全新设计一对引物Ｐ１、Ｐ２，结构如下：Ｐ１：ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＣＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＴ　　ＧＡＡＴＴＣ为ＥｃｏＲＩ酶切位点，Ｐ２：ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＴＡＧＧＧＣＧ　　ＡＡＧＣＴＴ为ＨｉｎｄⅢ酶切位点，从鱼类的肠系膜脂肪组织ＲＮＡ中扩增出了不同鱼的ｏｂ基因片断，并将ｏｂ基因分别克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体中，经酶切鉴定和聚合酶链反应（ＰＣＲ）鉴定后，进行序列测定，达到能够高效克隆出鱼类ｏｂ基因的目的。本发明专利技术每个引物含有一个特异性酶切位点，特异性酶切位点的存在为酶切签定和定向克隆提供有利条件。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种克隆技术，确切地说是从含有微量ob基因的鱼类总RM 中克隆出鱼类ob基因的方法。
技术介绍
1950年，Ingalls等发现一个基因的隐性突变可以导致肥胖，它将该基 因命名为肥胖基因(obese gene， ob基因)，第一次出现了ob基因的概念。 1994年底zhang等利用定位克隆技术克隆出了小鼠肥胖基因，并将该基因定 位于6号染色体上。自从人和小鼠的ob基因克隆后，ob基因一直成为国内外 研究的热点。ob基因编码的蛋白质称为瘦素(leptin),是反映体内脂肪含 量的重要信号因子，痩素(l印tin)主要作用于下丘脑的特异受体，通过 下丘脑进行摄食调控和维持能量代谢的平衡，痩素(l印tin)还对机体的 免疫应答，繁殖功能，神经内分泌等功能具有重要的作用，具有广泛的生 物学效应。现在已经克隆出了人、鼠、猪等动物的ob基因，并对其生物功 能和表达特点进行了深入的研究。而有关鱼类的ob基因及其功能的研究报 道相对较少。鱼类品种繁多，不同品种的鱼类具有不同的摄食习性，并且 鱼类体内脂肪的含量、摄食量以及饱食感与其摄食习性均有较大程度的差 异，而对鱼类ob基因的研究将有利于阐明不同品种鱼类的摄食习性与机体 的脂肪含量、摄食量以及饱食感之间的关系，对研究鱼类摄食调控的分子 机理具有重要意义。鱼类是一种变温动物，其生存环境与哺乳动物有^f艮大的不同，鱼类ob 基因与哺乳动物的ob基因存在较大的差异(Kurikawa et al.， 2005 );鱼类 脂肪组织的含量相对于其它动物较少，且鱼类脂肪组织中提取的总RM含量 亦非常低，因此通过克隆其它动物ob基因的方法较难克隆出鱼类ob基因。先前设计的引物虽然能克隆出鱼类Ob基因，但由于引物碱基数量较少，与鱼类ob基因保守序列同源性不高，因此在进行一步法逆转录-聚合酶链反 (RT-PCR)应时，对反应参数及核糖核酸(RNA)的质量要求非常严格，试验 成功率低， 一般克隆出一条鱼的ob基因需要2—3个月，时间较长。
技术实现思路
本专利技术全新设计一对引物，改进技术方案，能从含有微量ob基因的鱼 类总RNA中，克隆出鱼类ob基因。本专利技术从鱼类肠系脂肪组织中克隆鱼类ob基因的方法，包括下述具体步骤根据Genbank上公布的人、猪、鼠等动物的肥胖基因cDNA编码区序列 的相似性设计一对特异性引物P1、 P2,结构如下。Pl: GAGGAATTCGTGCCTATCCAGGAT GAATTC为酶切位点。 P2: GACAAGCTTCTCAGCATTAGGGCG AAGCTT为〃/滅I酶切位点。从鱼类的肠系膜脂肪组织(RNA)中扩增出了不同鱼的ob基因片段， 并将ob基因分别克隆至pMD18-T载体中，经酶切鉴定和聚合酶链反应(PCR ) 鉴定后，进行序列测定，达到能够高效克隆出鱼类ob基因的目的。本专利技术的有益技术效果体现在①本专利技术中的引物设计是在试验中逐 步完善的，较先前设计的鱼类ob基因引物有较大改进，本专利技术设计的引物 与鱼类ob基因保守序列有较高的同源性，反应的成功率较先前有所提高， 一般成功克隆出一条鱼的ob基因只需要20—30天的时间；且引物P1、 P2 含有AcMI 、 ^//^1I两个酶切位点，这两个酶切位点为常用酶切位点，许 多质粒载体中均含有该酶切位点，通过酶切后可与相应的质粒载体连接， 对鱼类ob基因的相关研究提供了便利；②本专利技术中的引物P1、 P2引入不 同的酶切位点，通过双酶切后可以与相应载体进行定向连接，有利于鱼类 ob基因序列测定、蛋白质的表达、功能等相关研究；③本专利技术能够从变温动物鱼类中克隆出ob基因，而此前国内学者方铃等与日本学者合作，未能 克隆出鱼类ob基因；Kurokawa等(2005 )根据已知动物的ob基因序列， 克隆出红鳍东方飩ob基因cDM序列，其所用引物等与本专利技术不同。 附图说明图1是鳙、鲢肠系膜脂肪組织总RNA电泳图。 图2是鳙、鲢ob基因的RT-PCR扩增图。图3是鳙、鲢ob基因的重组质粒pYong-ob和pLian-ob通过^7dlI+"'"^in 双酶切鉴定图。 具体实施例方式下面结合附图，通过实施例对本专利技术作进一步地说明。 实施例一、提取鱼类肠系膜脂肪组织总核糖核酸(RNA)变性液的配制25g异碌L氰酸胍溶于29. 3ml无RNA酶(RNase )的双蒸 馏水((1犯20)中，加入l. 76ml 0. 75mol/L柠檬酸钠(PH7. 0) 、 2. 64ml十二 烷基肌氨酸，临用前加入368微升(ul) P-巯基乙醇。其浓度分别为异 硫氰酸胍4mol/L、 ^宁檬酸钠25mmol/L、十二烷基肌氨酸0. 5%、 P-巯基乙 醇0. lmol/L。见图l所示，所采取的步骤如下① 取参庸 (Jr/sf/'c/^力7"S"刀o6/7/s )、 或链 (〃//70/>力^^// /^/^力/5"肠系膜脂肪组织lg，剪碎后加入装有12ml变性液的匀浆器中， 冰上匀浆30min,将匀浆液转入50ml聚丙烯离心管中；② 加入1. 2mL 2mol/L醋酸钠(NaAC), PH4. 0，充分混匀后，加入12mL 酚氯仿异戊醇(25 : 24 : 1 ),剧烈振荡10秒后水浴15 min;③ 4。C 12, 000转/秒离心20 min,取上清液于另一只50ml离心管中， 加入等体积的异丙醇，混匀后-20。C沉淀30min， 4°C 12， 000转/秒离心l5min;④去上清液，用5ml变性液溶解沉淀； 再用酚氯仿异戊醇(25 : 24 : l)抽提、离心、异丙醇沉淀等，重复步骤②、③一次； 去上清液后，将提取的肠系膜脂肪组织总核糖核酸(RNA)用10ml 6mol/L盐酸胍重新溶解，加入0. 05倍体积lmol/L水醋酸(HAC )和0. 75 倍体积的无水乙醇，混匀后-20'C放置15 min;⑦4。C 12，000转/秒离心10min，去上清液，沉淀物用75%乙醇漂洗， 真空干燥，将干燥的沉淀物用无核糖核酸酶(Rnase)的双蒸馏水(ddH20) 溶解，获得无杂质的肠系膜脂肪组织总核糖核酸(RNA)水溶液，置-70°C 保存备用；同时取O. 5ml电泳4企测，见图1。二、扩增获得鱼类的ob基因片段见图2所示，采用一步法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),按TaKaRa公司试剂盒说明书调制反应体系(50ul)如下10x—步法PCR緩冲液 5uL25 mmol/L氯化镁(MgCL2) 10uL 10鹏ol/L 三磷酸脱氧核苷酸混合溶液(dNTP) 5uL40U/ul RNA酶(RNase )抑制剂 luL5U/ul禽反转录酶(AMV RTase) XL luL聚合酶(Taq DNA ) luL20umol/L上游引物Pl luL20umol/L下游引物P2 luL肠系膜脂肪组织总核糖核酸(RNA) luL;Pl: GAGGAATTCGTGCCTATCCAGGAT GAATTC为fcoi I酶切位点。 P2: GACAAGCTTCTCAGCATTAGGGCG AAGCTT为"/滅I酶切位点。 反应参数为①50。C反转录30min， 94。C预变性5min;②进入聚合酶链反应(PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
从鱼类肠系膜脂肪组织中克隆鱼类ｏｂ基因的方法，首先提取鱼类的肠系膜脂肪组织总核糖核酸，其特征在于：　　　　（１）、取鱼肠系膜脂肪组织总核糖核酸，采用一步法逆转录－聚合酶链反应，用一对特异性引物Ｐ１、Ｐ２，所述特异性引物Ｐ１、Ｐ２结构如下：　　　　Ｐ１：ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＣＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＴ　　ＧＡＡＴＴＣ为ＥｃｏＲⅠ酶切位点，　　　　Ｐ２：ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＴＡＧＧＧＣＧ　　ＡＡＧＣＴＴ为ＨｉｎｄⅢ酶切位点，　　　　从鱼肠系膜脂肪组织总核糖核酸中扩增取得此鱼ｏｂ基因片段；　　　　（２）并将此ｏｂ基因片段克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体中，经酶切鉴定和聚合酶链反应鉴定后，进行序列测定，获得克隆的鱼类ｏｂ基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘庭双，龙良启，王永杰，戴汉川，侯冠军，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水产研究所，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]