复杂固态环境中微生物基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术提供了一种在复杂固态环境中直接提取微生物基因组ＤＮＡ的方法。该方法的具体步骤为：首先在样品中加入Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ然后进行细菌的破碎，随后在高离子浓度下使用ＣＴＡＢ除去蛋白质和有机类大分子物质，最后按常规方法从溶液中抽提ＤＮＡ；本发明专利技术方法快捷方便，得到的ＤＮＡ可供后续ＰＣＲ等分子实验操作使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微生物基因组DNA提取方法。特别是一种复杂固态环境中微生物基 因组DNA的提取方法。
技术介绍
近二十年来，科学家逐步利用分子生物学技术来研究微生物群落，这类方法能相对 便利的来研究微生物群落中的功能性种群，因为在现有的实验室条件下分离培养这些微 生物是非常困难的。用于此类研究的分子生物学技术一般包括PCR， DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis),测序，寡核苷酸探针和FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)等。16S rRNA基因是这类研究中使用最有效最普遍的分子标记。这些分 子生物学方法的进展使我们能对未能培养的微生物进行一定的研究，有助于我们对来自 各种环境中的未知微生物群落进行分类学和生态学层面上的研究。当前，对于各种复杂固态环境中微生物的研究已经成问热点，这类成分复杂的环境 包括沼气池，垃圾填埋场，活性淤泥等。在复杂固态环境中，微生物群落是一个复杂 和未知的群体，并在这类环境中起了非常重要的作用，比如厌氧发酵产生沼气，降解各 种废弃物，降解有毒污染物，代谢或富集重金属等。了解其中的微生物多样性及其群落 的结构有助于我们更深入的了解微生物的作用，从而能更好地来利用微生物，进一步可 以提高沼气池，污水处理池等的使用效率，帮助人类更好地走可持续发展的道路。当前，用于基因组DNA提取的方法很多，而直接从土壤等相对简单的环境中提取微 生物DNA的方法也有不少。但这类复杂的固态环境中包含大量杂质，比如各种金属离子 等无机物质，也包括腐殖质等各种有机物质，因此对DNA的提取造成了相当程度上的障 碍，并且影响到后续的分子生物学实验。
技术实现思路
本专利技术的目的在于填补现有技术中的空缺，提供一种可以迅速，简便的直接提取复 杂固态环境中微生物基因组DNA的方法。本专利技术的目的通过以下方案实现一种复杂固态环境中微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于该方法的具体步骤a. 在样品中加入玻璃珠或金刚砂、Extraction Buffer和溶菌酶，振荡混匀；37"C水浴 后室温下离心；吸取上清，加入SDS和蛋白酶K， 65。C水浴后室温下离心；吸取上清， 再加入氯化钠溶液和CTAB, 65。C水浴后离心； b.吸取上清，按常规提纯方法对上清液进行纯化分离，即得到微生物基因组DNA。 所述的步骤a中，按每1克样品加入lml的Extraction Buffer, Extraction Buffer 的组成为:Tris-HCl (lOOmM， pH8.0)' EDTA (lOOraM' pH8. 0)， NaH2P04 (lOOmM)， NaCl (500mM)和1。/。的CTAB;按每1克样品中加入20 50 y 1的SDS (10%)溶液；按每1克 样品中加入！0 30iU蛋白酶K (20mg/ml)溶液；按每1ml上清液加入400 u 1的氯化钠 (1M)溶液和100 ul的CTAB (10%)。本专利技术的优点是当前，对环境样品中微生物多样性的研究主要依赖于微生物DNA 的提取及后续的PCR等分子生物学手段的研究。因此必须建立一套能真实，全面反映环 境样品中微生物多样性的DNA提取方法，并使得到的基因组DNA能用于随后的PCR， 酶切等分子生物学实验中。本专利技术提供了一种能直接从复杂固态环境中提取DNA的方 法，并且得到的DNA能用于PCR等后续实验。此方法是一种快捷，简单的从复杂固态 环境中直接提取微生物基因组DNA的方法。此外，本方法不需要特别仪器，实验成本较 低。附图说明图1是采用本专利技术方法从上海市崇明岛长江口滩涂泥浆中提取得到的微生物基因组 DNA电泳图。图2是采用两种方法提取的微生物基因组DNA电泳图。其中，l和2为采用本专利技术方 法从沼气池浆样品提取微生物基因组DNA的电泳图；3和4为采用一般方法提取 得到的微生物基因组DNA的电泳图分别为。图3为采用两种方法提取的微生物基因组DNA的PCR产物电泳图。其中1和2为采 用本专利技术方法提取的DNA作为模板；3和4为采用一般方法提取到的DNA作为 模板.具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实例仅用于说明本专利技术而 不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常 规条件，如分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。所有试剂都是按《分子克隆实验操作手册(第三版)》 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)说明配制成质量/体积比浓度溶 液。实施例1:使用本专利技术方法对上海市崇明岛长江口滩涂泥浆中微生物基因组DNA的提取滩涂为沿海大潮高潮位与低潮位之间的潮浸地带，而崇明岛长江口滩涂不仅受到海 水浸润，也受到长江江水的冲洗。因此，滩涂中积累了大量来自上游长江携带下来的污 染物，同时含有无机盐类。在这种富含大量污染物并属盐碱地的环境下，多数植物难以 生长，只有在近陆地处有少数植物种类存在。使用本专利技术的方面可以成功提取到滩涂泥 浆中的微生物基因组DNA。本专利技术方法的提取过程称取样品0.84g，按以下步骤提取装入2ml离心管，加金刚砂，再加入lml的 Extraction Buffer和50 n 1的溶菌酶(20mg/ml)。振荡离心管3 min。将装有样品的离心管 放入水浴锅内，37'C水浴20 min，其间取出离心管振荡3次。室温下离心3 min， 3000 Xg。吸取上清，移入新的L5ml的离心管，加入30iU的10% SDS， 20iil的蛋白酶K (20mg/ml)，混匀后65。C水浴10min。在室温下离心5 min， 10000Xg。仔细吸取上清，并将上清液移入新的1.5ml的离心管，加入400iU的氯化钠溶液 (1M)， 100ul的CTAB (10%), 65。C水浴20min。 4。C下离心5min， 12000Xg。再吸取上清，移入新的1.5ml的离心管，加入lml的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀。4'C下离心5 min， 12000Xg。吸取上清，移入新的1.5ml的离心管，加入lml的氯仿:异戊醇 (24:1)，颠倒混匀。4"下离心5inin， 12000Xg。吸取上清，移入新的1.5ml的离心管，加入100ul的醋酸钠(3M,pH5.2),和lml的异丙醇，颠倒混匀，-2(TC下放置30min。4。C下离心15min, 12000Xg。弃上清，加1ml70。/。的乙醇洗涤沉淀，4'C下离心5min， 12000Xg。弃上清，晾干。 晾干后往管中加50y 1纯水溶解沉淀。取10u 1 DNA溶液用于琼脂糖凝胶电泳检测。琼 脂糖凝胶电泳所用琼脂糖浓度为1%的凝胶，含0.5yg/ml溴化乙锭，所用DNA分子量 标记(Marker)为北京鼎国生物技术有限责任公司的人DNA/EcoRI+HindIII，所用的电泳 缓冲也为TAE电泳缓冲液，以120V电压电泳25分钟。电泳结果见图1。可见用本方法 提取得到的DNA片段主要集本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复杂固态环境中微生物基因组ＤＮＡ的提取方法，其特征在于该方法的具体步骤为：：　ａ．在样品中加入玻璃珠或金刚砂、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ和溶菌酶，振荡混匀；３７℃水浴后室温下离心；吸取上清，加入ＳＤＳ和蛋白酶Ｋ，６５℃水浴后室温下离心；吸取上清，再加入氯化钠溶液和ＣＴＡＢ，６５℃水浴后离心；　ｂ．吸取上清，按常规提纯方法对上清液进行纯化分离，即得到微生物基因组ＤＮＡ；　所述的步骤ａ中，按每１克样品加入１ｍｌ的Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ，Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ的组成为：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１００ｍＭ，ｐＨ８．０），ＥＤＴＡ（１００ｍＭ，ｐＨ８．０），ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］（１００ｍＭ），ＮａＣｌ（５００ｍＭ）和１％的ＣＴＡＢ；按每１克样品中加入２０～５０μｌ的１０％的ＳＤＳ溶液；按每１克样品中加入１０～３０μｌ浓度为２０ｍｇ／ｍｌ的蛋白酶Ｋ溶液；按每１ｍｌ上清液加入４００μｌ的浓度为１Ｍ的氯化钠溶液和１００μｌ的浓度为１０％的ＣＴＡＢ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋任涛，濮佳，张荫雷，贺其其，袁轶伟，马中良，许政暟，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]