一种近海微生物高纯度大片段基因组的制备方法，将分离、收集的近海微生物菌体重悬于ｂｕｆｆｅｒ１中并和等体积的１～２％琼脂糖溶液混合形成包埋块，ｂｕｆｆｅｒ１是每升水中含０．１５～０．２５Ｍ ＮａＣｌ、４０～６０ｍＭ ＥＤＴＡ、８～１２ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５～８．５；琼脂糖是凝固点为３６～４０℃的分子生物学级琼脂糖；包埋块经裂解、消化和洗涤后进行电洗脱纯化和膜浓缩。得到高浓度、高纯度的大片段基因组ＤＮＡ，满足了构建宏基因组文库的需要。本发明专利技术采用电洗脱纯化基因组的方案，解决腐殖质类物质与ＤＮＡ共结合的难题，从而获得结构完整的大片段基因组ＤＮＡ，也避免了腐殖质类物质在后续构建基因文库时的干扰。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及构建宏基因组文库时大片段基因组的制备方法，特别涉及构建海洋微生物宏 基因组文库时大片段基因组的制备方法，确切地说是一种近海微生物高纯度大片段基因组的 制备方法。二
技术介绍
BAC (细菌人工染色体)作为有效的克隆和表达载体，能携带很大的DNA片段(40 ~ 400kb)，有利于构建大容量的基因组文库，从而确保了取样环境的基因多样性和丰富性；能 容纳整个基因簇和生物合成代谢途径，有利于新药物、新型生物催化剂和其他有价值的活性 物质的开发和利用。使用BAC载体构建宏基因组文库，要求有大片段、高纯度、结构完整 的基因组DNA.既要尽可能的提取环境样品中的基因组副A,又要保持片断的完整以获得完 整的目的基因或基因簇，还要足够的纯度以保证与载体的连接效率和转化感受态细胞的效 率。因此高质量的大片段基因组对于使用BAC载体构建高容量海洋微生物宏基因组文库至关 重要，对于不同环境的样品所采取的抽提纯化大片段基因组的方法也各不相同，因此发展了 多种方法抽提纯化基因组用于构建宏基因组文库。CN1511948A公开了一种构建基因文库的方法，通过该方法所构建的文库平均插入片段 为19kb。 CN182H02A公开了一种大片段海绵宏基因组DNA快速提取方法，按照此方法所提取 的基因组大小在50kb左右。CN101148676A公开了一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库 的方法，按照这种方法制备的基因组多集中在23 50kb。过小的片段不利于构建高容量的宏 基因组文库，不利于新药物、新型生物催化剂和其他有价值的活性物质的筛选，大大限制了 BAC载体作为大容量载体构建宏基因组文库进行功能筛选的优势。由于海洋环境的特殊性和生物多样性，海洋微生物具有不同于陆生微生物的独特代谢途 径和遗传背景，必定蕴含着独特的遗传资源。然而在近海这个独特的生态环境中，微生物群 体含量低而腐殖质相对含量高，直接提取基因组方法中所用的CTAB和PVPP的处理并不能完全 除去腐殖质类物质，仍然存在的污染物会抑制限制性内切酶的活性(Zhou， J., Bruns, M. A.， and Tiedje， J". M. (1996) DNA recovery from soils of diverse composition. Appl Environ Microbiol 62: 316~322)。另外，虽然通过这种方法所获得的基因组DNA产量高，但是大片 段基因组DNA在总基因组中的比率较低，片段大小低于100kb (Robe, P. ， RNalin, R.， Capellano， C., Vogel， T. ， Simonet， T. (2003) Extraction of DNA from soil 39:183~190)。在后续的必需处理步骤中机械力的作用和部分酶切的作用使得大片段基因组DNA 断裂变得更小，同时也使得大片段基因组DNA所占的比率更低，不利于构建大片段、高容量 和高覆盖率的宏基因组文库。采用琼脂糖包埋微生物菌体原位裂解的方法，在包埋微生物细胞的同时，腐殖质与微生 物细胞一起被包埋，在微生物细胞裂解后与基因组共结合，阻碍了后续部分酶切及与载体连 接等必需分子生物学步骤。在接下来的基因组DNA部分酶切中，通常采用两种方法， 一采 用琼脂糖酶酶解低熔点琼脂糖包埋块后进行大片段基因组部分酶切，琼脂糖的酶解在65 °C 或更高的温度进行，大片段基因组DNA在高温下不稳定易断裂。低熔点琼脂糖和琼脂糖酶价 格昂贵，目前国内并无企业生产，这种方案低熔点琼脂糖和琼脂糖酶用量大，增加了构建宏 基因组文库的成本。另外，停留在包埋块中的腐殖质会抑制琼脂糖酶的活性，使得酶解琼脂 糖发生困难。二采用限制性内切酶直接渗透进行酶切。限制性内切酶渗透入低熔点琼脂糖 包埋块中进行酶切，这种方法需要首先将琼脂糖块浸泡在无菌水中去除EDTA，接着放在酶切 缓冲液中让酶切缓冲液在包埋块中平衡，然后转移到酶切体系中让限制性内切酶在缓冲液中 和琼脂糖包埋块中达到平衡再进行酶切反应，最后加入EDTA并放置于冰上终止反应。该方法 步骤多耗时长，所需限制性内切酶量大，对样品的纯度要求高，若包埋块中存在着与基因组 DNA紧密结合的腐殖质将抑制限制性内切酶的活性，导致部分酶切失败。在包埋块中进行酶 切时需要每一步平衡都要充分，否则部分酶切条件难以重复。总之通过原位裂解的方法存在 三个问题， 一包埋块中腐殖质污染的问题，腐殖质与基因组DNA共结合使得后续的琼脂糖 酶消化、限制性内切酶酶切以及与BAC载体的连接效率低下甚至不能进行，导致构建文库失 败。二制备大片段基因组使用的低熔点琼脂糖和酶解琼脂糖包埋块所用的琼脂糖酶价格都 非常昂贵，使得构建文库成本高昂。三包埋块中低浓度的基因组DNA将使得后续的分子生 物学步骤无法进行。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足和实际需求，旨在提供一种制备近海环境微生物高纯度大片 段基因组的方法，进而使用BAC载体构建近海海洋微生物的宏基因组文库，用于新药物、新 型生物催化剂和其他有价值的活性物质的开发和利用。所要解决的技术问题是排除腐殖质的 干扰和解决基因组DNA的低浓度。本专利技术的技术方案包括微生物菌体的分离、收集、包埋、裂解、消化、洗涤、纯化和浓 縮，与现有技术的区别是所述的包埋是重悬于bufferl的微生物菌体和等体积的1~2%琼脂 糖溶液混合形成包埋块，所述的bufferl是每升水中含0. 15~0. 25M NaCl、 40~60mM EDTA、48~12mM Tris， pH7. 5~8. 5;所述的琼脂糖为凝固温度为36 40。C的分子生物学级琼脂糖； 包埋块经裂解、消化后释放出基因组DNA，洗涤除去蛋白酶K后进行电洗脱去除腐殖质得到 高纯度的基因组DNA，最后浓缩，所述的电洗脱在普通电泳槽中进行，4°C， 4~6 V/cm, 2~4h， 倒转电极1 2min，所述的浓缩是洗脱液置于0.025WI1的滤膜上，滤膜漂浮于浓度为 8~12wt%PEG8000的液面上进行浓縮。 具体操作过程如下1、 收集微生物菌体使用8 u m的滤纸过滤海水除去沙粒及真核类生物，通过0. 22 n m 的滤膜收集海水中的微生物细胞，使用刀片将微生物细胞从滤膜表面剥离，重悬于灭菌的 海水中。离心收集微生物菌体。2、 包埋微生物菌体微生物菌体重悬于buffer 1 (0. 15~0. 25 M NaCl， 40~60 mM EDTA, 8~12mM Tris; pH7. 5~8. 5)，与保温在42 46。C的浓度为1~2% (重量百分比)的琼脂糖溶液等体积充分混匀，注入包埋模具，冰上冷却形成包埋块。3、 裂解微生物细胞将包埋块置于40ml bufferl (bufferl中含终浓度0. 2%脱氧胆 酸钠，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/ml溶菌酶)在37。C裂解2 8h。4、 消化微生物细胞将包埋块转移到的buffer2 (lmg/ml of蛋白酶K， 1%十二烷 基肌氨酸钠，50mM/LTris, 0.5M/L EDTA; pH8.0)消化12~36h，然后更换新的buffer2 再消化12 36h，脉冲电泳检测制备的基因组DNA，结果见本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种近海微生物高纯度大片段基因组的制备方法，包括微生物菌体的分离、收集、包埋、裂解、消化、洗涤、纯化和浓缩，其特征在于：所述的包埋是重悬于ｂｕｆｆｅｒｌ的微生物菌体和等体积的１～２％琼脂糖溶液混合形成包埋块；所述的ｂｕｆｆｅｒｌ是每升水中含０．１５～０．２５Ｍ ＮａＣｌ、４０～６０ｍＭ ＥＤＴＡ、８～１２ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５～８．５；所述的琼脂糖是凝固点为３６～４０℃的分子生物学级琼脂糖；所述的纯化是包埋块经裂解、消化和洗涤后进行电洗脱纯化，电洗脱在普通电泳槽中进行，条件为４℃，４～６Ｖ／ｃｍ，２～４ｈ，然后反转电极洗脱１～２ｍｉｎ；所述的浓缩是洗脱液置于０．０２５μｍ的滤膜上，滤膜漂浮于８～１２ｗｔ％ＰＥＧ８０００的液面上进行浓缩。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：储新民，朱峰，孙宝林，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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