细胞质DNA的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种提取细胞ＤＮＡ的方法，采用以下过程：单细胞或外周白细胞－－细胞、线粒体的裂解－－ＤＮＡ变形与复性－－ＤＮＡ提取及纯化，直接从细胞中提取细胞质ＤＮＡ，所得ＤＮＡ样品完全可以满足常规分子生物学和分子遗传学如ＰＣＲ分析、ＤＮＡ探针的制备、ＤＮＡ杂交以及限制酶谱的构建等研究工作的需要，大大提高了ＤＮＡ的提取效率，而且成功率为１００％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从细胞中提取DNA的方法，特别是一种提取细胞DNA的方法。
技术介绍
真核细胞拥有两种类型DNA。 一种是核DNA(nDNA)，它是目前受到高度重视 的研究对象。另一种是细胞质DNA (mtDNA)，它位于线粒体内，仅占细胞总DNA 量的百万分之一到百分之一。与nDNA相比，细胞质DNA具有不同的遗传密码 和分子结构。人类细胞质DNA是一个闭合、环状的双链DNA分子，由16569个 碱基对(base pair ， bp)构成，其核苷酸序列已完全清楚。研究表明，人类神 经退行性疾病、糖尿病以及衰老的发病与细胞质DNA突变密切相关。恶性肿瘤 细胞细胞质DNA分子结构及表达调控研究已逐渐成为研究的热点。获取细胞质 DNA也是从事线粒体和叶绿体遗传研究的基础。传统的细胞质提取DNA方法分两 步提取，即首先将细胞中的线粒体或叶绿体分离出来，再进行抽提，其操作过 程繁琐，需要耗费大量的时间和实验材料，所得细胞质DNA质量不稳定，且数 量有限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种细胞质DNA的提取方法，通过该方法直接将细 胞质DNA从细胞中提取，避免了传统分两步抽提的弊端，且抽提效率高，所得为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是-一种细胞质DNA的提取方法，包括(1)从人体或动物体的细胞组织获得单 细胞，或从人体或动物体的外周血中获得外周白细胞的步骤，其关键在于还有 下列步骤-(2) 细胞、线粒体的裂解及DNA的变形与复性向装有细胞的离心管中加入溶液A，所加入溶液A的量按每107个细胞加 140 160ul计，在冰浴中吹吸均匀，然后加入溶液B，加入溶液B的量按每107 个细胞加290 310u 1计，颠倒混匀，然后放在冰浴中5 10分钟，再加入溶 液C，加入溶液C的量按每1()7个细胞加215 235"1计，再混匀，然后放在冰 浴中20 30分钟；上述溶液A中各溶质及其浓度为葡萄糖55mmol/L， EDTANa2 2H20 50画1/L ， Tris-HCl 0.025画1/L;上述溶液B中各溶质及其浓度为SDS 1%, NaOH 0.2mol/L; 上述溶液C中各溶质及其浓度为钾离子3mol/L，乙酸根离子5mol/L;(3) 细胞质DNA的提取将复性完毕的溶液离心，取上清液，再加入上清液1/2体积的Tris饱和酚， 振荡混匀，再加入上清液1/2体积的氯仿-异戊醇，氯仿与异戊醇的体积比为24-1，再振荡混匀，然后离心，取上层水相；(4) 细胞质DNA的纯化 加入所取上层水相等体积的异丙醇，冰浴25 40分钟，离心，弃上层水相，用0"C 65% 75%乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清层，沉淀干燥后得细胞质DNA。 本专利技术所述的细胞质DNA的提取方法，采用以下过程单细胞或外周白细胞——细胞、线粒体的裂解——DNA变形与复性——DNA提取及纯化，直接从细胞中提取细胞质DNA，所得DNA样品完全可以满足常规分子生物学和分子遗传学如PCR分析、DNA探针的制备、DNA杂交以及限制酶谱的构建等研究工作的需要。大大提高了DNA的提取效率，而且成功率为100%。作为优选实施例，在步骤(2)中，加入所述溶液A的温度为0'C 6'C。 作为优选实施例，在步骤(2)中，加入所述溶液B的温度为15°C 25°C。 作为优选实施例，在步骤(2)中，加入所述溶液C的温度为0"C 6"C。 作为优选实施例，在步骤(3)中，复性完毕的溶液的离心条件为离心加速度9000 11000 g,离心时间5 10分钟，离心温度2。C 6。C。作为优选实施例，在步骤(3)中，加入氯仿-异戊醇后的离心条件为离心加速度9000 11000 g，离心时间8 15分钟，离心温度2。C 6。C。作为优选实施例，在步骤(4)中，加入异丙醇后的离心条件为离心加速度14000 16000 g，离心时间8 15分钟，离心温度2。C 6。C。作为优选实施例，在步骤(4)中，加入乙醇后的离心条件为离心加速度14000 16000g，离心时间2 3分钟，离心时温度2°C 6°C。与现有提取方法相比，本专利技术的有益效果是(1) 本专利技术省时、成功率高，现有的提取方法分离纯化完整的细胞质DNA 需6h才能完成整个实验操作，本专利技术仅需4h就可完成，并且，经过58例次 重复性试验，成功率为100%;(2) 本专利技术采用的试剂为常规实验试剂配制而成，提取成本低，而且对实 验设备求不高。附图说明图1为所制得细胞质DNA样品的紫外光谱分析曲线。 具体实施例方式下面结合实施例进一步对本专利技术加以说明。实施例1 (1)细胞质DNA的制备将人体肺细胞组织研磨，用金属滤网过滤组织细胞，获得单细胞，用TBS 液(TBS液的配置方法取NaCl 8g， KC1 0. 2g， Tris 3g，加入去离子双蒸水 800ml溶解，用2mol/L HC1调节pH值至7. 4,双蒸水定容至1000ml。)清洗两 次，2000r / min离心，弃上清，再用STE液(STE液的配置方法取NaCl 5. 84g， 0. 5mol/L Tris-HCl 20ml, 0. 5mol/LEDTANa2. 2H20 2ml， 800ml去离子双蒸水溶 解，2mol/L HC1调节pH值至7. 4，双蒸水定容至lOOOml。)洗涤一次，离心弃 上清，沉淀中的细胞数为107。向细胞沉淀中加入4"C溶液A (溶液A的配置方 法取葡萄糖lg， 0. 5画1/L Tris-HCl 5ml， 0. 5mol/L EDTANa2 . 2H20 10ml， 加去离子双蒸水90ml， 2mol/L HC1调节PH值至8. 0，双蒸水定容至100ml。) 160W，在冰浴中吹吸混匀，再加入25'C溶液B (溶液B的配置方法用新鲜 配置的腦SDS 0. 2ml加入5mol/LNaOH 80ul，加入双蒸水1. 72ml，充分混匀。) 310ri，轻柔颠倒混匀，冰浴中裂解、变性10分钟，再加入4"C溶液C (C溶液 的配置方法为取乙酸钾29.44g，加双蒸水60ml充分溶解，加冰乙酸11.5ml， 加双蒸水28.5ml。) 轻柔混匀，冰浴中复性30分钟。复性完毕的溶液在10000g、 4。C条件下离心6分钟，取上清液，加入上清液1/2体积的Tris饱和 酚，温和振荡10分钟，再加入原上清液1/2体积的氯仿/异戊醇，氯仿与异戊 醇的体积比为24: 1，温和振荡5分钟，然后以10000g、 4'C，离心10分钟，轻取上层水相，加入所取上层水相等体积的异丙醇，冰浴30分钟，以15000g 离心10分钟，离心时的温度为4。C，弃上层水相，用0匸70%乙醇洗涤沉淀， 以15000g离心2分钟，离心时的温度为4X:，弃上清，空气中自然干燥沉淀， 所得沉淀即为细胞质DNA。上述细胞质DNA，必要时还可加入RNA酶消化操作过程中混入的RNA，经进 一步精练，可获得高纯度的细胞质DNA。 (2)细胞质DNA的鉴定用UV2754型紫外分光光度仪测定A230 、 A260 、 A280值，计算A230/PA260 、 A260/PA280比值，绘制核酸紫外吸收光谱曲线，如图1所示，结果显示，细胞质 DNA样品的最大光吸收值在260 nm处，最小光吸收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞质ＤＮＡ的提取方法，包括（１）从人体或动物体的细胞组织获得单细胞，或从人体或动物体的外周血中获得外周白细胞的步骤，其特征在于还有下列步骤：　（２）细胞、线粒体的裂解及ＤＮＡ的变形与复性　向装有细胞的离心管中加入溶液Ａ，所加入溶液Ａ的量按每１０↑［７］个细胞加１４０～１６０μｌ计，在冰浴中吹吸均匀，然后加入溶液Ｂ，加入溶液Ｂ的量按每１０↑［７］个细胞加２９０～３１０μｌ计，颠倒混匀，然后放在冰浴中５～１０分钟，再加入溶液Ｃ，加入溶液Ｃ的量按每１０↑［７］个细胞加２１５～２３５μｌ计，再混匀，然后放在冰浴中２０～３０分钟；　上述溶液Ａ中各溶质及其浓度为：葡萄糖５５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＥＤＴＡＮａ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ５０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ；　上述溶液Ｂ中各溶质及其浓度为：ＳＤＳ　１％，ＮａＯＨ　０．２ｍｏｌ／Ｌ；　上述溶液Ｃ中各溶质及其浓度为：钾离子３ｍｏｌ／Ｌ，乙酸根离子５ｍｏｌ／Ｌ；　（３）细胞质ＤＮＡ的提取　将复性完毕的溶液离心，取上清液，再加入上清液１／２体积的Ｔｒｉｓ饱和酚，振荡混匀，再加入上清液１／２体积的氯仿－异戊醇，氯仿与异戊醇的体积比为２４∶１，再振荡混匀，然后离心，取上层水相；　（４）细胞质ＤＮＡ的纯化　加入所取上层水相等体积的异丙醇，冰浴２５～４０分钟，离心，弃上层水相，用０℃６５％～７５％乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清层，沉淀干燥后得细胞质ＤＮＡ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡义德，孙恒文，刘丽红，钱海洪，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]