基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法，其采用的纳米传感器，包括捕获探针、DNA引物、量子点QD及核苷酸外切酶；捕获探针包括Cy5、生物素和单链DNA1，单链DNA1的3'末端连接Cy5，单链DNA1的5'末端连接生物素，量子点QD为链霉亲和素结合的量子点，通过链霉亲和素‑生物素相互作用将捕获探针修饰到量子点QD的表面；DNA引物为一种DNA序列，DNA序列能够在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下将脱氧核苷酸添加至DNA序列的3'末端，聚合延伸形成单链DNA2，单链DNA2能与单链DNA1杂交形成双链DNA；核苷酸外切酶为能够将双链DNA中的单链DNA1从3'羟基末端进行消化掉的酶。采用该纳米传感器能够简单、快速、灵敏的检测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。

【技术实现步骤摘要】
基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法
本专利技术属于生物分析
，涉及基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法。
技术介绍
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是一种核内核酸酶，它可以在不需要DNA模板的情况下，将核苷酸随机引入单链多聚脱氧核苷酸链的3'-羟基(3'-OH)末端。通过向T和B细胞中的T和B细胞受体基因的变量(V)，依赖(D)和连接(J)外显子区添加非模板核苷酸(N区)，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可以在免疫球蛋白重链基因重组过程中加入基因片段，产生多种形式的连接，为抗原抗体的多样性做出很大的贡献。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的活性在大多数人体细胞中是抑制的，但在急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞(急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞来源的胸腺依赖型细胞系)，急性骨髓单核细胞白血病细胞和慢性骨髓性白血病(CML)中是非常高的。因此，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可以作为人类白血病的生物标志物。此外，由于其能够对单个DNA片段添加高度可变数目的核苷酸，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可被广泛用作检测核苷酸、酶、金属离子以及DNA损伤位点的通用工具。尽管末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)具有多种生物学功能，但目前已报道的对其检测的方法很少。凝胶电泳法和免疫测定法是检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的标准方法。凝胶电泳检测法是基于将放射性标记的三磷酸脱氧核苷酸聚合到单链DNA(ssDNA)底物的3'-OH末端，但是会遭受到放射性污染和繁琐的操作程序等缺点。免疫学检测法采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)特异性抗体，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性进行定量，但是需要复杂的抗体制备，多步骤的固定和分离，从而造成耗时长，成本高等问题。近些年来，已发展出多种检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的新方法，包括比色法，发光法以及荧光法。在比色法中，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的存在使得单链DNA引物能够延伸得到富含鸟嘌呤(G)的DNA产物。该多鸟嘌呤(G)DNA产物可以与辅因子血红素结合折叠形成G-四链体结构，在过氧化氢(H2O2)存在下，ABTS2-将被氧化成有色的ABTS-。在发光法中，是基于环金属化铱(III)复合物表现出对双链DNA(dsDNA)和单链DNA(ssDNA)上i-基序DNA的高差异的反应性。在荧光法中，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)诱导产生的长链多聚胞嘧啶(C)核苷酸序列可以与Ag+离子结合，形成包囊银簇(DNA-AgNCs)，从而产生增强的荧光信号。但是以上这些方法仍然存在一些不可避免的缺点，如检测灵敏度低，材料合成繁琐以及需要复杂的化学反应等。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的之一是提供一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的纳米传感器，采用该纳米传感器能够简单、快速、灵敏的检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的活性。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的纳米传感器，包括捕获探针、DNA引物、量子点QD及核苷酸外切酶；所述捕获探针包括Cy5、生物素和单链DNA1，所述单链DNA1的3'末端连接Cy5，所述单链DNA1的5'末端连接生物素，所述量子点QD为链霉亲和素结合的量子点，通过链霉亲和素-生物素相互作用将捕获探针修饰到量子点QD的表面；所述DNA引物为一种DNA序列，所述DNA序列能够在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下将脱氧核苷酸添加至所述DNA序列的3'末端，聚合延伸形成单链DNA2，所述单链DNA2能与所述单链DNA1杂交形成双链DNA；所述核苷酸外切酶为能够将所述双链DNA中的单链DNA1从3'羟基末端进行消化掉的酶。本专利技术中通过生物素和链霉亲和素间的特异性反应，在3'末端修饰Cy5荧光分子的捕获探针单链DNA1将结合在量子点的表面，然后与通过在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下形成的聚合单链DNA2进行杂交，从而形成Cy5-dsDNA-QD纳米结构，导致Cy5荧光分子与量子点之间引发荧光共振能量转移(FRET)。当末端脱氧核苷酸转移酶不存在时，DNA引物无法聚合延伸形成单链DNA2，从而不能与单链DNA1进行杂交形成双链DNA。因此核苷酸外切酶将无法对双链DNA中的单链DNA1进行消化，从而将不会导致Cy5荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上进行释放而引发高效率的荧光共振能量转移(FRET)；而当末端脱氧核苷酸转移酶存在时，DNA引物能够聚合延伸形成单链DNA2，从而能与单链DNA1进行杂交形成双链DNA。加入核苷酸外切酶，双链DNA中的单链DNA1将被消化，使得Cy5-dsDNA-QD纳米结构上的Cy5荧光分子和单链DNA2同时被释放，而释放的单链DNA2将会与新的单链DNA1引发新一轮的杂交、消化和释放，从而导致大量的Cy5荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上被释放出来，造成低效率的荧光共振能量转移(FRET)。从而实现简单、快速、灵敏的检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的活性的目的。本专利技术的目的之二是提供一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的试剂盒，包括上述纳米传感器。本专利技术的目的之三是提供一种上述纳米传感器或试剂盒在检测末端脱氧核苷酸转移酶活性中的应用。所述应用以非疾病的诊断与治疗为目的。本专利技术的目的之四是提供一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法，采用上述纳米传感器或试剂盒，其过程包括：(1)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化聚合2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)核苷酸到DNA引物的3'末端形成单链DNA2，单链DNA2与量子点上捕获探针中的单链DNA1杂交形成双链DNA；(2)核苷酸外切酶将从所述双链DNA中的单链DNA1的3’羟基末端方向逐步切去单核苷酸，使得Cy5-dsDNA-QD纳米结构上的Cy5荧光分子和单链DNA2同时被释放，释放的单链DNA2将会与新的单链DNA1引发新一轮的杂交、消化和释放，从而导致捕获探针的Cy5荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上被释放出来，造成低效率的荧光共振能量转移(FRET)；(3)通过对整个反应后的产物进行了荧光光谱和强度的测量，从而定量检测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。本专利技术的有益效果为：1.高灵敏性：本专利技术具有超高灵敏性，可归因于(1)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的高效聚合反应，(2)量子点(QD)供体与多个Cy5受体之间的高效的荧光共振能量传递(FRET)，(3)核苷酸外切酶介导的捕获探针的高效循环消化，(4)高灵敏的单分子检测。因此本方案可以实现高效、灵敏地检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性。2.特异性好：由于本专利技术是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可以将核苷酸随机引入单链(ss)多脱氧核苷酸链的3'-羟基(OH)末端，而不需要DNA模板。其能够向单个DNA片段添加高度可变数目的核苷酸，从而保证了该方法的高度特异性。另外，对本专利技术中的各反应条件也都进行了详细的优化。因此在DNA引物的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化聚合反应中，极少发生非特异性反应，而且核酸外切酶III(ExoIII)只能从双链DNA(dsDNA)底物的3'凹端逐步去除单核苷酸，这也大大减少了该方法检测的非特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的纳米传感器，包括捕获探针、DNA引物、量子点QD及核苷酸外切酶；所述捕获探针包括Cy5、生物素和单链DNA1，所述单链DNA1的3'末端连接Cy5，所述单链DNA1的5'末端连接生物素，所述量子点QD为链霉亲和素结合的量子点，通过链霉亲和素‑生物素相互作用将捕获探针修饰到量子点QD的表面；所述DNA引物为一种DNA序列，所述DNA序列能够在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下将脱氧核苷酸添加至所述DNA序列的3'末端，聚合延伸形成单链DNA2，所述单链DNA2能与所述单链DNA1杂交形成双链DNA；所述核苷酸外切酶为能够将所述双链DNA中的单链DNA1从3'羟基末端进行消化掉的酶。

【技术特征摘要】
1.一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的纳米传感器，包括捕获探针、DNA引物、量子点QD及核苷酸外切酶；所述捕获探针包括Cy5、生物素和单链DNA1，所述单链DNA1的3'末端连接Cy5，所述单链DNA1的5'末端连接生物素，所述量子点QD为链霉亲和素结合的量子点，通过链霉亲和素-生物素相互作用将捕获探针修饰到量子点QD的表面；所述DNA引物为一种DNA序列，所述DNA序列能够在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下将脱氧核苷酸添加至所述DNA序列的3'末端，聚合延伸形成单链DNA2，所述单链DNA2能与所述单链DNA1杂交形成双链DNA；所述核苷酸外切酶为能够将所述双链DNA中的单链DNA1从3'羟基末端进行消化掉的酶。2.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，捕获探针单链DNA1将通过生物素和链霉亲和素的特异性反应结合在量子点的表面，每个单链DNA1的3'末端修饰Cy5荧光分子。3.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，所述单链DNA1的DNA序列从5'到3'依次为AAAAAAAAAAAA；或，所述DNA引物的DNA序列从5'到3'依次为ATGGGCGGCA；或，所述核苷酸外切酶为核酸外切酶III。4.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，所述双链DNA为所述的单链DNA2与所述的单链DNA1杂交形成双链DNA，其所述的双链DNA的3'末端为凹端。5.一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的试剂盒，其特征是，包括权利要求1～4任一所述的组合物；优选的，包括所述DNA引物延伸反应溶液，所述DNA引物延伸反应溶液中含有氯化钴，2'-脱氧胸苷5'-三磷酸核苷酸和1×末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液。6.一种权利要求1～4任一所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒在检测末端脱氧核苷酸转移酶活性中的应用。7.一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法，其特征是，采用权利要求1～4任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，王黎娟，罗明丽，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37