使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测制造技术

本发明专利技术提供用于检测核酸聚合酶构象中的变化的方法和组合物，所述方法涉及将非共价地连接至单壁碳纳米管(SWNT)的核酸聚合酶与第一核苷酸或第一核苷酸类似物及模板接触；以及通过测量核酸聚合酶与构象上变化的核酸聚合酶之间在SWNT中的第一电导变化来检测构象上变化的核酸聚合酶。所述方法适用于多核苷酸的测序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测相关申请的交叉引用此申请要求2014年12月18日提交的美国临时申请号62/093,671的权益，所述申请的内容据此以引用的方式整体并且出于所有目的并入本文。关于在联邦资助研究和开发下作出专利技术权利的声明本专利技术是受政府支持完成，由国立卫生研究院提供的1RO1CA133592-01号基金资助及由国家科学基金会提供的ECCS-1231910号基金资助。政府对本专利技术享有某些权利。对表格形式或以ASCII码文件提交的计算机程序列表附件形式的“序列表”的引用写入文件48538-526001WO_ST25.TXT中的序列表据此以引用的方式整体并且出于所有目的并入本文，该文件创建于2015年12月13日，2,828个字节，机器格式IBM-PC,MS-Windows操作系统。背景在DNA测序产业内，合成(非天然)分子的使用是用于区分构成DNA的四个核苷酸碱基(A、C、T及G)的主要策略。此策略被成功地应用于Sanger测序的古老方法，该方法是用于最初的人类基因组研究。存在用于DNA测序的技术，但对于可提高速度、减小错误率并降低复杂性、成本及试剂需要的新技术有商业需要。对可使用电子电路进行DNA测序的技术有极大关注，因为固态电子学可在速度、成本及复杂性方面提供许多益处。近年来，已产生电子构造，其是通过使DNA穿过纳米孔并且监测穿过同一孔隙的离子电流或者通过使DNA穿过纳米孔但使用相邻的电隧道结转导转运来操作。两个平台都依赖DNA穿过纳米孔，因此它们共有在纳米孔下操作的特征性困难，如不稳定性、脆性及精确的流体处理需要。此外，DNA穿过纳米孔具有有限的信噪比，以使得实际上必须使用荧光法独立地证实任何测序信息。另外，高错误率及“滑动”穿过纳米孔限制了应用，如为具有短串联重复的高度重复序列测序，这是人类鉴别应用需要的。生物传感器是掺入生物识别元件的分析装置，该生物识别元件在空间上直接与转导元件接触。此整合确保生物事件向可检测信号的快速及适当转化。在不同的电生物感测构造中，基于场效应晶体管(FET)的装置已经吸引了极大的关注，因为它们是一种类型的生物传感器，这种生物传感器可将靶分子(例如生物分子)与晶体管表面的相互作用直接转化为可读的电信号。在标准场效应晶体管中，电流沿着连接到两个电极(源电极和漏电极)上的导电路径(沟道)流动。源电极与漏电极之间的沟道电导是由第三(栅)电极接通并且断开，该第三电极通过薄介电层进行电容性耦合。场效应晶体管检测靶化学品并且测量化学浓度以用于广泛的商业应用，包括例如工业过程控制、泄露检查、排出流监测以及医学诊断。例如，在美国专利申请号13/626,760中公开了一种电子装置，其对在单分子水平下的检测足够敏感。使用其上连接有单个敏化分子的导电沟道实现本专利技术的方面。因此，其中公开的装置监测单分子反应的动态，并且可用于重要的单分子生物化学测定，如在单分子测序反应中的检测器。因此，在本领域中存在对下一代DNA测序技术的需要，该技术比现有技术更高效并且有更多信息。本文提供了对本领域中的这些及其他问题的解决方案。概述本文尤其提供了具有天然和非天然核苷酸碱基的混合物以测定DNA样品的基因序列的电路。描述了使用电路来测定DNA链的遗传密码的专项技术和具体实施。所述电路使得能够为DNA测序并且通过延伸，对RNA及碳水化合物进行测序。本专利技术提供了一种低成本、高速、高保真度的DNA测序方法，其可成功地与更传统的测序方法竞争。本文所提供的方法和组合物可依据酶促加工期间单分子的活性。合成的底物、核苷酸及荧光团可用于由DNA链产生独特的和可区分的信号。附图简述图1A-1C.用化学修饰的dNTP电监测KF活性。图1A：单KF纳米电路及测试其通过KF掺入的化学修饰的dNTP。(a)单壁碳纳米管场效应晶体管(SWCNT-FET)经由被引入“指状物”子域中的单半胱氨酸非共价地生物缀合至DNA聚合酶I(KF)的单分子上的示意图。芘-马来酰亚胺接头(黄色)经由π-π堆叠粘附到SWCNT-FET上并且共价地连接到单半胱氨酸上以固定KF。SWCNT-FET在SiO2上生长，连接到源极和漏极金属电极上，并用聚合物(PMMA，红色)钝化。图IB：原子力显微镜显示具有单KF连接(7nm，箭头)的1-2nm直径的SWNTFET。图1C：本文所公开的类似dNTP的化学结构。突出显示了来自天然dNTP的化学修饰。图2A-2F.天然和类似dNTP掺入期间的电流变化。图2A：在此电流测量中，在聚(dC)42模板及其互补天然dGTP存在下，ΔI(t)偏移在每个碱基掺入期间发生。高和低电流状态分别对应于酶的开放和闭合构象。图2B-2F：对应于图2A(时间窗1.5至2.5s)的数据的时间放大倍数示出了对应于dGTP(图2B)、α-硫代-dGTP(图2C)、6-氯-2APTP(图2D)及2-硫代-dCTP(图2E-2F)的碱基掺入的切换事件的减少。在图2B-2F各自的右边，放大视图描绘了每个所示碱基的单个ΔI(t)偏移，突出显示了单碱基分辨率，其中条棒表示1ms时间间隔。图3A-3B.在来自>50s数据组的所示dNTP掺入期间的开放τ开放和闭合τ闭合状态持续时间的概率分布的直接比较。Y轴是以对数概率％绘制。对于τ闭合(图3A)和τ开放(图3B)两者，均聚物聚(dC)42提供模板。在图3A-3B中，每个核苷酸的单指数拟合显示为实线。图4A-4B.在聚(dA)42的加工中产生的电子信号。图4A：当KF在天然的核苷酸三磷酸脱氧胸苷(dTTP)存在下加工聚(dA)42时，各碱基对掺入产生负电流尖峰ΔI<0。图4B：当dTTP被非天然核苷酸2-硫代-2’-脱氧胸苷-5’-三磷酸(2-硫代-dTTP)取代时，碱基掺入产生正电流尖峰ΔI>0。图5A-5C.在异质性底物的加工中产生的电子信号。图5A：当KF在所有四种天然核苷酸(dNTP)存在下加工异质性底物时，每个碱基对掺入产生负电流尖峰ΔI<O。个别尖峰可如所示列举，但一般说来，它们不能将一种类型的碱基与另一种相区分。图5B：图5B显示用被2-硫代-dTTP取代的dTTP对相同数据集的模拟。在硫醇化脱氧胸苷下，正尖峰现表示(#2、6、7)掺入T核苷酸时的位置。图5C显示当KF在与某些类似物混合的天然核苷酸(dNTP)存在下加工异质性底物时，所得图案含有可用于鉴别所选的碱基的正和负电流尖峰。此实施例示出了使用与6-Cl-2APTP混合的三种天然核苷酸(dATP、dTTP、dCTP)作为用于G掺入的类似物获得的数据。将此信息用于寡核苷酸的纳米管测序方法中。图6.附图描绘了在过表达和纯化之后KF的代表性15％SDS-PAGE凝胶。将KF纯化至>95％同质性并且在约68kDa的预期质量下迁移。图7.附图描绘了基于荧光的活性测定，其展示了在稳态条件下的KF(L790C)(黑色圆形)和野生型KF(灰色圆形)活性。引物延伸反应在dATP、dTTP、dCTP及dGTP存在下发生。用背景减去原始数据，背景测量了在dNTP不存在下的活性。图8A-8B.附图描绘了显示用本文所述的模板掺入dNTP类似物的整体测定。将具有dNTP类似物和A/T掺入模板(图8A)或G/C掺入模板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测核酸聚合酶构象中的变化的方法，所述方法包括：(i)将非共价地连接至单壁碳纳米管(SWNT)的核酸聚合酶与第一核苷酸或第一核苷酸类似物及模板核酸序列接触，由此形成结合至所述第一核苷酸或所述第一核苷酸类似物及所述模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶；(ii)通过测量核酸聚合酶与构象上变化的核酸聚合酶之间在SWNT中的第一电导变化来检测构象上变化的核酸聚合酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.18 US 62/093,6711.一种检测核酸聚合酶构象中的变化的方法，所述方法包括：(i)将非共价地连接至单壁碳纳米管(SWNT)的核酸聚合酶与第一核苷酸或第一核苷酸类似物及模板核酸序列接触，由此形成结合至所述第一核苷酸或所述第一核苷酸类似物及所述模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶；(ii)通过测量核酸聚合酶与构象上变化的核酸聚合酶之间在SWNT中的第一电导变化来检测构象上变化的核酸聚合酶。2.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合酶与第一核苷酸类似物接触。3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括(iii)基于由所述第一电导变化产生的第一信号鉴别所述第一核苷酸或第一核苷酸类似物。4.如权利要求3所述的方法，其还包括：(iv)允许所述构象上变化的核酸聚合酶释放所述第一核苷酸或第一核苷酸类似物，由此改造所述核酸聚合酶。5.如权利要求4所述的方法，其还包括(v)将非共价地连接至单壁碳纳米管(SWNT)的核酸聚合酶与第二核苷酸或第二核苷酸类似物及所述模板核酸序列接触，由此形成结合至所述第二核苷酸或第二核苷酸类似物及所述模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶；以及(vi)通过测量所述核酸聚合酶与结合至第二核苷酸或第二核苷酸类似物及模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶之间在SWNT中的电导变化来检测所述构...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·G·柯林斯，G·A·韦斯，崔龙起，T·奥尔森，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US